含内参的登革病毒与基孔肯雅病毒3重荧光定量PCR检测方法的建立与评估-公共卫生专业论文.docxVIP

硕士学位论文采样日期，各种实验室检测方法阳性率。2．引物、探针设计及标准品的制备：从GenBank中尽可能多的收集登革病毒(1-4型)及基孔肯雅病毒的基因序列，使用BioEdit6．12软件进行基因序列比对，分析病毒的保守序列，使用PrimerExpress3．0进行引物与探针设计。使用模板扩增引物分别扩增登革病毒和基孔肯雅病毒的基因保守片段，对扩增后目的基因进行纯化，连接至T．Vecter，转化至感受态细胞中，在含有Ampicillin的LB琼脂平板上涂板，培养，挑菌后，进一步测序证实插入片段正确。采用DropletDigitalPCR方法确定质粒浓度。人工合成一段基因作为内参，并对其设计引物与探针。3．实时荧光定量RT．PCR特异度和灵敏度检测：将质粒标准品进行10倍系列连续稀释，使用多重荧光定量PCR检测方法进行检测，制作标准曲线，评估登革病毒与基孔肯雅病毒3重实时荧光定量PCR方法检测的检出限。选用日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、辛德毕斯病毒各一株进行检测，评估此检测方法特异性。4．实时荧光定量RT．PCR检测临床样本：294份登革热疑似病例血清样本及33份基孔肯雅病毒疑似样本，每份样本均进行基因测序和多重实时荧光定量RT．PCR两种方法的检测，以基因测序作为病毒检测的金标准，统计学方法计算分析实时定量RT．PCR方法的灵敏度、特异度、阴阳性符合率等指标。三、结果：1、参与评估不同发病日期不同检测方法阳性率的所有血清样样本采集时间为0—19天，其中男性有212人(49．0％)，女性有221人(51．0％)．病人平均年龄为40．69(1-89)岁。2、实时荧光定量PCR检测所有病例总阳性病例数为321，阳性率为74．13％，快速免疫层析法和NSl酶联免疫检测阳性病例数(阳性率)分别为350(80．8％)III万方数据摘要和350(80．8％)。这三种检测方法在登革热发病急性期检测结果均呈现较高的阳性率，特别是在发病后3．9天(三种检测方法发病日检测阳性率均超过80％)。而病毒IgG和IgM总阳性率较低(低于50％)，发病日第九天之后，登革病毒IgG酶联免疫检测开始呈上身趋势。3、登革病毒3’端非结构蛋白编码区和基孔肯雅病毒CDS区完成引物和探针设计。T．A克隆方法成功构建出带有基孔肯雅病毒和登革病毒目的基因片段的质粒标准品。4、标准曲线与检出限：质粒浓度为9．2×105copies／ul和4．3×105copies／ul，质粒标准品稀释后CT值与浓度之间均具有良好的线性关系。登革病毒标准曲线为Y=39．66．3．60l×lgX，R2=O．997。基孔肯雅病毒标准曲线为Y=40．22．3．46419X，R2=0．999。登革病毒最低检测限为9．2×103copies／ml，基孔肯雅病毒最低检测限为4．3×103copies／ml。5、重复性与特异度：登革病毒检测重复性试验结果显示，不同浓度质粒标准品检测的CT值的变异系数在1．59％．3．80％之间，不同浓度标准品间的CT值差异具有统计学意义(F=354．212，P0．0001)，相同浓度标准品间CT值差异无统计学意义(F=0．007，P0．05)。基孔肯雅病毒检测重复性试验结果显示，不同浓度质粒标准品检测的CT值的变异系数在1．59％．3．80％之间，不同浓度标准品间的CT值差异具有统计学意义(F=958．625，P0．0001)，相同浓度标准品问测CT值差异无统计学意义(F=0．002，P0．05)。检测日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、辛德毕斯病毒各一株，均为阴性，特异度为100％。6、临床样本评估：登革病毒检测灵敏度为100％，特异度为89．3％，阳性预测值为92．1％，阴性预测值为100％。基孔肯雅病毒检测灵敏度，特异度，阴、阳性预测值结果均为100％。四、结论：本实验首先根据发病后不同采血日期对市面上登革病毒检测方法进行万方数据硕士学位论丈评估，指导实验室选择最优方法进行登革病毒检测。接着，针对登革和疾控肯雅病毒建立了含内参的三重荧光定量RT．PCR方法，具有快速诊断、灵敏度、特异度高、重复性好的特点，并且可对病毒进行定量。关键字：登革病毒；基孔肯雅病毒；病原检测；实时荧光定量PCRV万方数据硕士学位论文Developmentofamultiplexreal--timeRT-．PCRassaywithaninternalcontrolfordetectionofdengueandchikungunya●VlrUSeSName：XujingSupervisor：Prof．KeChangwenABSTRACTBackgrounds：Denguehaemorrhagicfever(DHF)andchikungunyafeverarecasedbydenguevi