贵阳及其周边地区动物弓形虫感染的初步调查及弓形虫地理株的分离与基因型鉴定-免疫学专业论文.docxVIP

贵阳及其周边地区动物弓形虫感染的初步调查及弓形虫地理株的分离和基因型鉴定 贵阳及其周边地区动物弓形虫感染的初步调查及弓形虫地理株的分离和基因型鉴定 贵阳医学院 贵阳医学院 2013 届基础免疫学硕士学位论文 PAGE 1 贵阳及其周边地区动物弓形虫感染的初步调查及弓形虫地理株的分 离和基因型鉴定 专业：基础免疫学 研究生：聂歆闻 导师：李永念 教授 摘 要 目的： 以贵阳及其周边地区猫、猪和狗等动物弓形虫感染的流行病学调查为基础， 分离弓形虫虫株,鉴定该地理区域内弓形虫的基因型，为贵州省弓形虫的防治工 作提供依据。 方法： 1. 采集圈养猪、家养狗和流浪猫的外周血或心脏及脑组织样本。 2. 采用 ELISA 法检测血浆中的弓形虫抗原 CAG、抗弓形虫抗体 IgG、IgM；PCR 检测弓形虫特异性核酸序列 529bp。结合弓形虫抗原、抗弓形虫抗体、弓形 虫 DNA 检测，作为判断弓形虫感染的依据。 3. 选择经确认弓形虫感染的动物组织样本，采用小鼠腹腔接种分离弓形虫虫株。 4. 采用 PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）和基因测序技术分析弓形虫 DNA 样 本的 SNP(单核苷酸多态性)，鉴定研究区域内的弓形虫基因型。 结果： 1. 采集猪 70 头，家养狗 107 只，流浪猫 19 只。血清学检测发现，抗弓形虫 IgG 抗体阳性率猪为 70%，狗为 20.56%，猫为 63.16%；抗弓形虫 IgM 抗体阳性率 猪为 0，狗为 0.93%，猫为 21.05%；弓形虫循环抗原（CAG）阳性率猪为 16.88%， 狗为 13.08%，猫为 10.53%。PCR 扩增弓形虫 529bp 特异性片段，其阳性率猪 为 31.51%，狗为 3.74%，猫为 52.63%。综合弓形虫抗原、核酸和抗弓形虫抗 体的检测结果，动物弓形虫感染率平均为 55.61%，其中猪为 80%，家养狗为 34.58%，流浪猫为 84.21%。 2. 基于弓形虫血清学和核酸检测结果，用小鼠腹腔接种法分离出 5 株弓形虫贵 州地理株，这些弓形虫株有增殖慢、毒力低、易形成假包囊等生物学特点。 3. 多重-巢式多位点 PCR-RFLP 和基因测序技术分析源自不同动物的 36 个弓形虫 DNA 样本，结果表明该地区动物感染的弓形虫具有相同的基因型特征。 结论： 1. 贵州省圈养猪和流浪猫的弓形虫感染情况比较严重，家养狗的感染率则相对 较低。 2. 动物弓形虫感染以慢性或隐性感染为主，近期感染或急性感染者少见。 3. 贵阳及其周边地区所采集的弓形虫 DNA 样本具有一致的 SNP 多态性，属于弓 形虫不典型基因型，初步分析可能为 “Chinese 1”型。 关键词：弓形虫 流行病学 腹腔接种 PCR-RFLP 基因分型 1.前言 弓形虫是专性寄生于有核细胞内的原虫。猫科动物是弓形虫唯一的终宿主， 弓形虫在其小肠上皮进行有性生殖，形成卵囊。包括猫科动物在内，几乎所有的 温血脊椎动物都可以是弓形虫的中间宿主[1]。 弓形虫感染在世界各地非常普遍。它是一种重要的人畜共患病病原体，危害 人和动物的健康。妇女妊娠期间初次感染弓形虫，可发生流产、死胎、先天性弓 形虫病等不良妊娠结局[2,3]。对于免疫低下的人群，如艾滋病、恶性肿瘤患者、 接受移植的患者等，弓形虫可引起机会性感染如弓形虫脑炎、弓形虫肺炎等，病 情严重甚至致死[4,5]。动物感染弓形虫后的结局与人相似，通常以隐性感染为主， 但是某些情况下会发生严重的弓形虫病，此外，弓形虫感染雌(禽)畜后可能发生 死胎、流产、仔（禽）畜发育不良等繁殖障碍[6,7,8]。 人类和动物在弓形虫的生活史中联系密切。猫感染弓形虫后，排出的卵囊污 染土壤和水，使人类和动物通过粪口途径感染弓形虫。机体感染后，弓形虫通常 以组织包囊的形式持续存在于动物体内，当前食用含有组织包囊的生肉，是人或 食肉动物感染弓形虫的重要途径[6]。 动物和人群中弓形虫感染状况的流行病学调查是防控弓形虫病的基础性工 作。中国人群和动物弓形虫感染非常普遍[10]。1995 年，调查 14 省 3 种家禽、12 种牲畜弓形虫感染状况，血清学平均阳性率为 16.28%[9]。2005 年全国人体寄生 虫调查办公室调查 15 个省弓形虫感染状况，人群平均感染率为 7.97%，标化血 清学阳性率最高的是贵州省，为 15.09%[11]。 猪感染弓形虫后可以发生急性弓形虫病。1952 年美国首次报道了猪急性弓 形虫病，1976 年日本多个养殖场爆发猪急性弓形虫病，损失严重。1977、1978 年，上海、江苏、辽宁等省流行猪“无名高热”病，病死率达 30%左右，经上海 农科院鉴定，病原体是弓形虫[12]。1995 年，北京海淀某猪场爆发急性弓形虫病， 猪场 7383