用于血清中药物的分析的试验前处理的有机溶剂主要是甲醇和乙腈.PDF

用于血清中药物的分析的实验前处理的有机溶剂主要是甲醇和乙腈。 沉淀蛋白后再分析仍是常用的方法。 通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加人适 量的沉淀剂或变性剂, 它们的作用是蛋白质脱六而沉淀如有机溶剂、 中性盐有的 是由于蛋白质形成不溶性盐而析出如一些酸类三氯醋酸、 高氯酸、 磷酸、 苦味酸, 以及重金属离子汞离子、铜离子, 离心后取上清液用于分析。 甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中性盐有硫酸铵、氯化铵 等。 无机盐沉淀蛋白是可逆的即将样品稀释后蛋白仍具有生理活性而有机溶剂与 酸类沉淀的蛋白是不可逆的, 用甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清凉, 沉淀为絮 状易于分离，乙睛与之相反, 产生细的蛋白沉淀。 在做血浆样品时，用甲醇或乙腈沉淀蛋白，一般用血浆与沉淀剂的比例为乙 腈最低 1:2（一般1:3 以上） ，甲醇最低 1:3（一般 1:5 以上） ，有实验显示以血清： 水：乙腈为 1：2：4.5 时去除效果最好。 蛋白质沉淀法有： 1．热变性及酸碱变性沉淀法 用于选择性的除去某些不耐热及在一定 PH 值 下易变性的杂蛋白。 2．有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时 也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独 应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀 用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．盐析法 一、盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程 叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多 肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段多用于各种 蛋白质和酶的分离纯化。 二、有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数， 导致具有表面水层的生物大分子 脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白 质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤 较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大 分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机 溶剂沉淀法不如盐析法普遍。 有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙 酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。 有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果： 1） 温度 低温可保持生物大分子活性， 同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH 与盐析法中的作用基本相 同；3）金属离子一些多价阳离子如锌离子和钙离子在一定PH下能与呈阴离子状 态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降， 而且不影响蛋白质的生物活性。4）离子强度 盐浓度太大或太低都对分离有不利 影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍 体积为宜。 三、等电点沉淀法 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 不同的两性电解质具有不同 的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调 PH8.0 去除碱性蛋白质，再调 PH3.0 去除酸性蛋白质。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分 危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属 离子时，必须注意调整 PH 值。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉 淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。 四、生成盐复合物沉淀法 1．金属复合盐法 许多有机物质包括蛋白在内，在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成沉 淀。 根据有机物与它们之间的作用机制， 可分为羧酸、 胺及杂环等含氮化合物类， 如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类，如概镁铅；亲硫氢基化合物类，如汞银铅。 蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏 感，调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂），即可沉淀多种蛋白。 2． 有机盐法 含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合 物而沉淀析出。但此法常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，需采用 较温和的条件，有时还需加入一定的