视网膜Müller细胞体外培养探究.docx

视网膜M ti Iler细胞体外培养探究 摘要：Muller细胞是视网膜中有着重要作用的神经 胶质细胞，针对该细胞的体外培养国内外也做了大量的工 作，本文就目前视网膜M U Iler细胞的体外培养、分离、鉴 定、纯化等方法的研究进展进行综述。 关键词：视网膜；Mil Iler细胞；细胞培养 MU Iler细胞是视网膜神经胶质细胞中最主要和最重要 的胶质细胞，参与了视网膜神经节细胞的代谢、内环境稳态 以及神经递质的运输、摄取和代谢［1］。因而Mtiller细胞 在视网膜神经节细胞的生长、损伤、修复和再生中起到重要 的作用，是引起多种眼底疾病甚至导致失明的原因之一［2, 3］。现今对视网膜M tiller细胞的研究也经越来越受到重视, 努力探寻一种最有效的体外培养视网膜Mil Iler细胞的方 法，以便更好的研究视网膜Muller细胞的功能及作用成为 热点之一。 1培养板、培养皿的预处理 视网膜M Uller细胞在体外能更好的培养生长，常常需 要对培养板、培养皿进行包被预处理，这样有利于视网膜胶 质细胞的贴壁生长，常用的包被物有鼠尾胶原、层黏连蛋白、 多聚氨基酸等［4, 5］o 1.1鼠尾胶原包被法 参照我国学者任海涛等［6］的方 法，通过对SD大鼠鼠尾进行剥离取得鼠尾腱，用Tris-HCl缓 冲液、胃蛋白酶处理后获得鼠尾胶原蛋白原液、然后反复进 行分级盐析、复溶得到鼠尾胶原蛋白。使用时用高纯度蒸饱 水稀释成0. lmg/ml的质量浓度，再以50ul/cm2的量均匀涂 抹覆盖于培养板、培养皿的全部底层表面，然后再室温静置 放30min左右。吸除多余的的液体，予少量的灭菌蒸馆水洗 涤，然后将水吸净即可。 1. 2层黏连蛋白和多聚氨基酸包被法用lug/ml的层黏 连蛋白或者0. lmg/ml的多聚氨基酸直接加入培养板、培养 皿盖过内底板于371过夜［7］。或者先用多聚氨基酸包被2h, 37°C,然后再吸净，然后加入层粘连蛋白覆盖全部底层表面, 然后371过夜。吸净液体即可。 1.3我国学者赵丽萍等［8］得出各种支持物的效果大小 依次为人羊膜上皮面、鼠尾胶原、多聚鸟氨酸、板素、纤维 连接蛋白、人羊膜基底面、I型胶原。但是因为羊膜的透明 度比较差，在显微镜下难以辨认培养细胞的轮廓，实际使用 比较少，而鼠尾胶原、多聚氨基酸胶原透明，操作简单，故 常被首选使用。 2培养基 2.1含血清培养基血清含有细胞生长必须的营养成分， 能够促进体外培养细胞贴壁生长。血清可以增强视网膜神经 胶质细胞在体外的存活率。 2.2无血清的合成培养基无血清培养基按照细胞组分 及浓度的差别，分为许多种类。马伟等使用无血清培养基 (NeurobasalTM-A Medium)成功培养出视网膜神经细胞［9］。 3材料来源 在视网膜神经胶质细胞的体外培养中，眼球的来源主要 选取哺乳动物如狗、树?［10］、兔、猪、鼠、猴、猫、人等。 在实际实验中，人的眼球是最好的研究对象，但材料来源有 限，而且涉及伦理学方面的问题，因而非常难得。鼠的大体 解剖和人相似，大脑比较发达，新陈代谢较其他动物更接近 人，价格比较适宜，被大多数学者作为取材对象，一般选取 小于lw内的幼鼠［11, 12］。 4视网膜Mu Iler细胞的培养方法 4. 1组织块培养法在无菌条件下，将SD乳鼠断头处死, 取出眼球，用含庆大霉素和青霉素的PES液浸泡，在解剖显 微镜下距锯齿缘1mm处剪开眼球，去除玻璃体及眼前节，剥 取视网膜组织，将其剪成大小约2mmX2mm的视网膜组织， 将其接种于培养瓶中，贴壁后加入含胎牛血清的培养基，放 置于37￡含95%的氧气和5%的二氧化碳的培养箱中培养 ［13］ o 4. 2酶解法在无菌条件下，将SD乳鼠断头处死，取出 眼球，用含庆大霉素和青霉素的PBS液浸泡，在解剖显微镜 下距锯齿缘1mm处剪开眼球，去除玻璃体及眼前节，剥取出 视网膜组织后，将其剪成大小约lmmXlnini的视网膜组织， 加入消化酶，放置于37￡含95%的氧气和5%的二氧化碳的培 养箱中消化成单细胞终止消化，在1000r/min, 4。（3的条件下 离心5min,弃上清。加入培养液，吹打成悬浮液，然后移入 培养瓶中，放置于379含95%的氧气和5%的二氧化碳的培养 箱中培养［13］ o 5视网膜M Uller细胞鉴定的方法 5. 1倒置相差显微镜下观察早期视网膜M uller细胞， 具有比较典型的形态学特征：胞体较大，略呈长梭形，胞 质丰富，细胞核大，位于细胞中央或偏位，多呈椭圆形，有 2个或2个以上的核仁，细胞有粗大突起［14］。但由于后期 细胞形态变化大，因此不宜作为细胞鉴定的方法。 5.2透射电镜鉴定Mano T等［15, 16］把透射电镜下细 胞内含直径为8?10nm的微丝作为Mil Iler细胞的标志