德国NanoTemper---分子间相互作用测量仪MST.PDF

德国 Nano Temper 分子间相互作用测量仪 MST 最新的分子间相互作用分析技术平台 快速、无需固定、低样品量、天然溶液、高灵敏度 技术优势： ☆ 快速 ：在10 分钟之类测量解离常数 ☆ 高灵敏范围 ：从离子和片段结合到复合物间作用 ☆ 天然的环境条件 ：直接在血清和裂解液中测量 ☆ 样品使用量低 ：nM 的浓度下只需4ul 样品量 ☆ 溶液测量 ：不需要固定到固相表面 ☆ 动力学范围 ：亚-nM 和 mM 的解离常数 ☆ 极低消耗费、无维护费、简单易操作 工作原理： 微量热泳 （MST ）是一种分析生物分子的技术。微尺度热泳是粒子在微观的温度梯度 中的定向运动。生物分子结 构/构象的变化引起的水化层的变化导致的沿温度梯度运动的相对变化可以用来确定亲和力。甚至像蛋白质磷酸化或小 分子结合到靶标上都可以被监测。MST 也允许直接在溶液中测量分子间相互作用，而不需要一个固定的表面（无需固 定）。MST 是由总部设在慕尼黑的德国高科技公司 NanoTemper 技术有限公司发展出来的。 微尺度热泳（MST ）是一种新的方法，可以定量分析溶液中微升的分子间的相互作用。 MST 是基于热泳效应，即 沿温度梯度定向的分子运动。一个空间的温度差ΔT 导致分子浓度在温度升高的地区的变化 ，用 Soret 系数 ST 定义为 ： / = EXP （-S ΔT ）。 C 热 C 冷 T 热泳取决于分子和溶剂之间的界面。在恒定的缓冲条件下，热泳反映出分子大小，电荷和溶剂化熵。 一个荧光标 记分子 A 的热泳由于大小、电荷和溶剂化熵的差异通常显著不同于分子和靶标形成的复合物 AT。这种分子的热泳的区 别可以用来量化在一定缓冲条件下，梯度滴定实验的结合常数。 MST 技术介绍 测量荧光标记分子的热泳运动是通过监测荧光毛细管内分布 F。微观的温度梯度产生的红外激光，这是集中到毛细 管强烈被水吸收。 水溶液在激光光斑的温度升高ΔT= 5 K.之前的红外激光是在同质化的荧光分布 F 是毛细管内观察到 的冷切换。 当红外激光开关，两方面的影响，其时间尺度分离，有利于新的荧光分布 F 热。 热弛豫时间快和诱导荧光 染料，由于当地环境的依赖反应温度跳跃约束力的依赖下降。 在较慢的扩散时间尺度（10 秒），分子运动从局部加热 区域外的低温地区。 当地的分子浓度降低，直到达到一个稳态分布在激烈的地区。 虽然质量扩散 D 的决定消耗的动力学，S T 确定的稳态浓度比例下温度上升 c /c =exp(-S ΔT) ≈ 1-S ΔT。归 hot cold T T 一化荧光 Fnorm = F 热/ F 冷主要是这个浓度比，除了温度跳跃∂F /∂T。 的线性近似，我们发现：Fnorm = 1 + （∂F /∂TST ） 的温差。由于荧光强度的线性和热泳枯竭，Fnorm （A ）未结合的分子归荧光和约束复杂的Fnorm （AT ）线性叠加。 表示 x 的绑定到目标分子的一小部分，在目标 T 滴定的荧光信号不断变化的计算公式如下：Fnorm =(1-x) Fnorm(A)+x Fnorm(AT)。 定量绑定参数获得通过的约束力基板的连续稀释。通过绘制 F 规范对系列稀释的不同浓度的对数，获得一个 S 形 的结合曲线。这种结合曲线，可以直接安装质量作用定律的非线性解与解离常数 K ð ，作为结果。微量热泳 （MST ）是 一种分析生物分子的技术。微尺度热泳是粒子在微观的温度梯度中的定向运动。生物分子结构/构象的变化引起的水化 层的变化导致的 实验流程： 很简单的实验方法,避免了昂贵的样品消耗和繁琐的制备过程。 结合毛细管使用，大大降低其他的标准的分子相互作用的技术所需的实验成本 ，并且可以测量天然状态环境中的生 物分子间的相互作用。 荧光分子的浓度的保持不变而结合分子的浓度梯度增加。一个 4 ul 的样品量被填充在 MST 毛细血管 ，然后使用制 造一个局部温度梯度。由于标记分子在玻璃毛细管中的运动导致的区域荧光强度变化就会被观测到。既可用标签/萤光 蛋白来发光(NT.115 系统) ，也可以用色氨酸自发荧光来检测(NT.LabelFree 系统)。