改良低温螯合法分离家兔小肠绒毛和隐窝细胞及分离-动物营养学报.PDF

动物营养学报２０１６，２８（５）：１４４２⁃１４４９ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１６．０５．０２０ 改良低温螯合法分离家兔小肠绒毛和 隐窝细胞及分离效果鉴定 沈雪梅　 李　 晶　 张　 刚　 崔宏晓　 刘丽慧　 姚军虎　 徐秀容∗ （西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 ７１２１００） 摘　 要： 本试验旨在研究家兔小肠绒毛和隐窝细胞的分离方法，为深入研究小肠上皮结构与功 能提供体外模型。 试验以新西兰白兔为试验材料，在不同螯合剂浓度［５、１０、１５、２０、２５ ｍｍｏｌ／ Ｌ 乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）］和螯合温度（４、２５ ℃）下分离小肠绒毛和隐窝细胞，检测所分离细胞团 的产量、形态、细胞活率、完整性。 结果表明：１）各螯合条件下分离的绒毛和隐窝细胞形态完整， 基因组ＤＮＡ 与总ＲＮＡ 完整；２）螯合温度越高且ＥＤＴＡ 浓度越大时，细胞富集率越高，但对细胞 毒害作用也越强，４ ℃、５ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＥＤＴＡ条件下绒毛和隐窝细胞富集率分别为７．７５％和 １．０１％， 绒毛相对完整率和隐窝细胞相对活率分别为９１．６７％和９３．４８％；２５ ℃、２５ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＥＤＴＡ 条件 下绒毛和隐窝细胞富集率则分别高达１７．８９％和４．９９％，但绒毛相对完整率和隐窝细胞相对活率 仅为４．２５％和５．１７％；３）综合分析后确定，４ ℃、１０ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＥＤＴＡ条件下分离效果最佳；４）在最 － 佳条件下所分离隐窝富集物的溶菌酶和 α 防御素的相对表达量极显著高于绒毛富集物（Ｐ＜ － ０．０１），显示细胞纯度较高；且隐窝细胞经培养９ ｈ后溶菌酶和α 防御素的相对表达量未发生显 著变化（Ｐ＞０．０５），显示细胞依然具有较高活力。 由此可见，改良的低温螯合法适用于家兔小肠 绒毛和隐窝细胞的高效分离。 关键词： 隐窝；绒毛；肠上皮细胞；螯合剂；家兔 中图分类号：Ｒ３２９　 　 　 　 文献标识码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１６）０５⁃１４４２⁃０８ 　 　 小肠是机体消化吸收的重要部位，其功能与 离时间长、隐窝和绒毛分离效果差、细胞活率低等 ［１２］ 肠上皮细胞密切相关，单层柱状上皮细胞覆盖在 问题。 Ｐｏｔｈｉｅｒ等 使用含 １．５ ｍｍｏｌ／ Ｌ 乙二胺四 肠腔组成小肠的上皮，上皮弯曲折叠有序地排列 乙酸（ＥＤＴＡ）的盐溶液在３７ ℃条件下螯合孵育肠 成绒毛和隐窝，其中上皮凸向肠腔形成的叶状结 组织，分 离 的绒 毛 和 隐窝 细胞 互 相 掺 杂， ［１３］ 构为绒毛，下陷至固有层形成的指套状结构为隐 富集率低；Ｂｊｅｒｋｎｅｓ 等 将 ＥＤＴＡ 浓度提高为 ［１］ ３０ ｍｍｏｌ／ Ｌ，虽然分离时间缩短且提高了富集率， 窝 。 绒毛和隐窝的细胞组成及生理功能不同， ［１４］ 分离培养可用于探讨不同的生理问题，如绒毛培 但对绒毛损伤很大；Ａｙａｂｅ 等 在此基础上将分 －