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酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物机制探究 ［摘要］以欧洲花楸悬浮培养细胞(SASC)为材料， 检测酵母提取物(YE)处理后SASC生理生化指标的变化， 初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制。结果表明: YE诱导SASC合成了 5种联苯类化合物，且5种化合物含量 随诱导时间的延长呈现不同的变化规律；YE处理抑制细胞的 生长；细胞培养液中的pH随着处理时间的延长逐渐降低； 细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势，YE 处理组(YE组)可溶性蛋白质含量与对照组(CK组)相比 显著增加，最高时相对增量达到了 147. 76%； CK组和YE组 细胞外Ca2+都表现为内流，但YE组的内流明显小于CK组。 说明YE诱导使细胞处于一种胁迫状态，不利于细胞的生长, 迫使细胞合成了联苯类化合物抵御外界胁迫；细胞内可溶性 蛋白可能作为酶类参与调控化合物的合成；Ca2+信号分子可 能介导细胞应对YE胁迫的信号转导。 ［关键词］欧洲花楸悬浮细胞；酵母提取物；次生代谢 产物；机制 ［收稿日期］2013-12-20 ［基金项目］国家自然科学基金项目()； 国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02 , 2012BAI28B002) ［通信作者］郭兰萍,Tel: (010) E-mail： glp01@126. com ［作者简介］黄蕾，E-mail： hnlei~27@163. com 欧洲花楸Sorbus aucuparia L为蔷薇科苹果亚科花楸 属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高山区域 ［1］,其干燥成熟果实可食用和入药［2］。我国花楸属植物50 余种，资源丰富，供药用者约6种［2］。目前研究发现，苹 果亚科植物受到外界病原菌侵害时特异性地产生联苯类化 合物作为植保素［3］, Kokubun T等使用铜离子处理欧洲花楸 叶片后，可以从叶片中分离出欧花楸素［4］,这种联苯类化 合物在健康的植株中并不存在，且其具有广泛的生物活性。 欧洲花楸是集药用、食用、林和生态价值于一身的珍贵树 欧洲花楸是集药用、食用、 林和生态价值于一身的珍贵树 种。 欧洲花楸悬浮细胞（SASC）生长速度快、周期短，可作 为很好的研究材料［5］,已有研究发现用酵母提取物（YE） 作为诱导子处理可使SASC迅速合成联苯类化合物［6］。但是, 目前这类具有植保素作用的化合物合成机制尚不明确，还有 待进一步的研究。 本实验以SASC为材料，通过检测YE处理后SASC次生 代谢产物的变化及其细胞培养液中pH、可溶性蛋白含量、细 胞外Ca2+流等生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC 合成次生代谢产物的机制，尤其是从可溶性蛋白和钙离子2 个方面为机制研究提供了很好的思路和方向，为更深层次地 研究打下基础。 1材料 欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所叶和春 研究员赠送。 培养箱(Conviron Adapt is CMP6010)；超大型摇床 (ZYSA0351)；电子天平(Sartorius BS 2202S)；超净工作 台(SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台)；分析型酸度计 (JENWAY3510)；高效液相仪(Waters 2695_2996)； UV 检测 器(T6 新世纪 19-1650-01-1169)；液质联用仪(Agilent 6320 Ion Trap)；其他常规设备。 牛血清蛋白为美国MP公司产品；Yeast extract为OXOID 公司产品；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。 2方法 2.1细胞悬浮培养体系的建立 诱导出的欧洲花楸愈伤 组织接种于含50 niL MS固体培养基的400 mL广口瓶中，愈 伤组织每14 d继代1次，经过3?5次继代后，选择疏松 的愈伤组织转入液体培养基中培养，每250 mL三角瓶中分 装50 mL的液体培养基，置于25匸培养箱中暗培养。悬浮 细胞培养转速设定为120 r - min-lo实验中使用的欧洲花 楸悬浮细胞是将减压过滤后的1.4 g细胞接种于含有20 mL MS液体培养基的100 mL三角瓶中。 2. 2 YE诱导子的配制及处理用蒸锚水溶解酵母提取物, 配制60 g ? L-1的母液，高压灭菌。参照Liu B等处理方法 [6],处理终浓度为3 g ? L-lo 2.3欧洲花楸悬浮细胞中次生代谢产物的提取和检测 将收获的细胞用15 mL甲醇在研钵中研碎，使用滤纸和漏斗 将滤液过滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用10 mL甲醇 提取1次，合并滤液，将鸡心瓶置于旋转蒸发仪上浓缩至干。 培养基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分离，将乙 酸乙酯层倒入提取细胞后的鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上浓 缩