钩藤抑制基质金属蛋白酶活性及治疗脑血管疾病机理实验探究.docxVIP

钩藤抑制基质金属蛋白酶活性及治疗脑血 管疾病机理实验探究 【摘要】 目的 本文旨在研究钩藤是否具有抑制基质金 属蛋白酶(MMPs)活性的作用，从而为从分子水平上研究钩 藤治疗脑血管疾病的机理奠定基础。方法根据抑制MMPs 活性后底物降解速率降低的原理，通过检测底物降解速率， 测定中药钩藤提取物对MMPs的抑制作用。结果钩藤具有 抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=52 u g/mlo结论 钩藤具有抑制基质金属蛋白酶活性的作用，其治疗脑血管疾 病的机制可能因为其具有抑制脑血管中的基质金属蛋白酶 活性有关。 【关键词】 钩藤；基质金属蛋白酶；脑血管疾病 doi： 10. 3969/j. issn. 1004-7484(x).2013.01.023 文 章编号：1004-7484 (2013) -01-0023-02 脑血管疾病主要包括高血压、脑缺血、脑出血、脑血栓 [1],这一系列疾病致残率及致死率及高，严重危害人民的 健康并增加了社会医疗的负担。对于脑血管疾病的进一步诊 治，已经成为目前关注的热点问题。国外文献发现，大部分 脑血管疾病发病与基质金属蛋白酶的变化有关[2],基于此, MMPs已成为治疗及预防脑血管疾病的一个新靶点。目前应用 于临床脑血管类疾病治疗的药物多为中药制剂，钩藤作为中 药防治脑血管疾病的常规药物，其用药历史悠久，费用较低, 且已知副作用较少因而被广泛应用于临床中［3］。本实验对 钩藤体外抑制基质金属蛋白酶活性进行研究如下。 1实验仪器与实验材料 1.1实验材料 钩藤（内蒙古民族大学附属医院中药 房提供的道地药材），缓冲溶液应用自治（50mM HEPES, 10mM CaC12, 0.2M NaCl, 0.05% Brij-3520 uM ZnS04）,荧光 底物 DQ-gelatin （Sigma 公司、美国）。 1.2 实验仪器 Bio-Tek ELx-808荧光酶标仪（宝 特），DNP-9272-1电热恒温培养箱（常州恒德仪器制造股 份公司）。 2原理与方法 2. 1实验原理本实验采用可激发荧光的底物为底 物，基质金属蛋白酶降解荧光底物后发荧光，通过荧光酶标 仪检测荧光的变化强度并记录数值。如果在反应体系中加入 药物的提纯物质，药物提纯产物中的抑制成分与基质金属蛋 白酶结合，从而影响荧光底物的反应，使其荧光强度发生变 化。 2.2实验方法 2. 2. 1提取物的制备 将钩藤3g放入水中（100摄氏 度）持续时间3小时，滤纸三重滤过得沉淀物，应用冻干机 处理后，得到钩藤水提取物。配制的药物起始浓度为lg/1 每升增加浓度lg,最高浓度为6g/l的水提取物溶液。 2. 2.2抑制活性的测定 将6种浓度的钩藤水提取物 分别取1卩1与一定量的基质金属蛋白酶T6加入96孔酶标 板中，然后加入缓冲溶液，使其最终体积为50 ul,放入37* 培养箱中孵育30分钟，然后加入含有0. 2ug荧光底物缓冲 溶液50 ul,最终反应体系为1 OOul,钩藤水提取物最终浓 度分别为 lOug/ml、20 U g/ml, 30 u g/ml. 40 u g/ml 50 u g/ml 和 60u g/ml,立即用 Bio-Tek ELx-808 荧光酶标 仪进行计算，发射波长为520nM,激发波长为460nM。实验 时间为500秒。仪器计算的荧光强度就等同于酶降解底物活 力的强弱。 2. 2. 3抑制活性计算 用Vo代表没有加入抑制剂组的 荧光强度变化，Vi代表加入抑制剂组的荧光强度变化，钩藤 的抑制百分数用下边的公式表示：1一Vi/Vo二抑制百分数 （%）,当抑制百分数为50%时，则为钩藤抑制基质金属蛋白 酶活性的IC50o 3结果 具体结果如下，图中“Mean V”表示随时间变化的荧 光强度的变化速率，可以作为相对的底物降解速率，根据实 验方法中所给出的公式，能够计算出不同浓度的钩藤提取物 对基质金属蛋白一16的抑制百分数。通过以上数据，我们能 够推测基质金属蛋白酶一16的活性抑制50%时所需要的钩藤 的量，如图 8, IC50=52 ug/mlo 3讨论 钩藤始载于《名医别录》，原名钓藤。甘苦；微寒，归 肝、心包经，具有清热平肝；熄风止痉的作用［4］,被历代 医家成为因其疗效确切，副作用较少，长期以来一直被应用 于脑血管疾病的治疗之中。 基质金属蛋白酶是一类自然进化中高度保守的酶。基质 金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)通过自身的表达调控基质 金属蛋白酶的含量。当机体出现神经系统疾患时，基质金属 蛋白酶受到疾病影响后其表达水平向上调节，使基质金属蛋 白酶抑制剂与基质金属蛋白酶之间的平衡失控，因为这种基 质金属蛋白酶含量的升高，细胞外基质成分被过多降解，从 而为许多疾病如脑血栓、脑出血、高血压等疾病［5］的发