基因工程的主要技术原理.pptVIP

1. 穿梭质粒（shuttle plasmid） 五、构建双杂交体系的穿梭质粒 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 （1）BD-plasmid P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。 筛选标志：TRP 核定位信号是GAL4本身的一部分 ADH：Alcohol dehydrogenase （2）AD-plasmid 外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 筛选标志：LEU2 核定位信号是SV40的T抗原的序列 六、酵母双杂交的实验过程 1. 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 2. 把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424） 3. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 报告基因：HIS（合成组氨酸） 4. 筛选观察 （1）存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。 Trp- Leu- 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。 （2）蛋白结合选择 His- Trp- Leu- 反应 切割 碱基修饰 修饰碱基的转移 DNA链的断裂 R1 GA 硫酸二甲脂 pH7.0加热 氢氧化钠 R2 AG 硫酸二甲脂 酸 氢氧化钠 R3 C+T 肼 六氢吡啶 六氢吡啶 R4 C 肼+盐 六氢吡啶 六氢吡啶 R5 G 硫酸二甲脂 六氢吡啶 六氢吡啶 R6 G+A 酸 酸 六氢吡啶 R7 C+T 肼 六氢吡啶 六氢吡啶 R8 C 肼+盐 六氢吡啶 六氢吡啶 R9 AC 氢氧化钠 六氢吡啶 六氢吡啶 R10 GA 硫酸二甲脂 pH7.0加热 六氢吡啶 R11 G 亚甲蓝 六氢吡啶 六氢吡啶 R12 T 四氧化锇 六氢吡啶 六氢吡啶 3. 碱基特异的化学切割法 4. 测序过程 每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。 特点： 读出的序列就是要测的序列。 Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。 测序读片 90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。 1. 原理 （1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形 成完全的双链分子。杂交效率最高。 三、DNA杂交测序 （2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。 （4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。 8mer探针有48= 65536 种序列。 如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。 （5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。 5’-AGCCTAGC-3’ Target 3’-TCGGATCG-5’ Probe 假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。 但： 12mer靶DNA 与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。 3’-TCGGATCG-5’ 3’-CGGATCGA-5’ 3’-GGATCGAC-5’ 3’-GATCGACT-5’ 3’-ATCGACTT-5’ 5’-AGCCTAGCTGAA-3’ 12-mer target 8-mer probe 假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。 （1）DNA芯片（chip） 把寡聚核苷酸探针的3‘端或5’端与玻璃或凝胶形成共价连接。 目前可以做出65536 种8-mer探针芯片。 2. 技术要点 每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。 DNA chip 杂交 （1）非放射性标记 1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。 四、DNA自动化测序 荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。 1. 技术要点 （2）不同的标记对象 既可标记引物，也可标记ddNTP。 （4）分析自动化 （3）读片的自动化 激光探头直接读胶，实时阅读。 （2）反应的自动化 Sanger脱氧终止法。 电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。 （5）反应可在一个试管中进行 标记ddNTP时。 2. 荧光标记引物的自动化测序 ①分别用4种荧光物标记引物， ②区分反应产物， ③混合电泳， ④激光一次读胶， ⑤电脑合成结果。 3. 荧光标记ddNTP自动测序原理图解 4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP。