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非融合绿色荧光蛋白标记EV71型人肠 道病毒的构建 耿磊窦惮王清路 齐鲁巨药学院 齐鲁 巨药学院 摘要： 目的构建非融合绿色荧光蛋口 (EGFP)标记的肠道病毒71型(EV71),为 EV71抗病毒机制研究及抗病毒药物的筛选提供方法。方法 取野生型病毒EV71, 在EV71基因组的3D蛋白编码区后添加HBV的link序列，将EGFP基因连入link 与EV71型病毒3非翻译区之间，构建EGFP标记的EV71病毒基因组，并转染横 纹肌瘤RD细胞以获得EV71-1 i nk-EGFP重组病毒。采用PCR方法鉴定重组病毒中 link、EGFP 位置。感染 RD 细胞后 24、48、72、96、120、144 和 168 h 时收获 病毒，采用组织半数感染量法测定病毒滴度，绘制病毒生长曲线，比较重组病 毒与野生型病毒的生长动力学。RT-PCR测定EGFP转录表达。将重组病毒感染RD 细胞后72 h裂解，采用Western blotting法检测RD细胞中GFP、Pl蛋白的表 达情况。重组病毒感染RD细胞后，经过13轮传代，Western blotting法检测 EGFP基因稳定性。结果RD细胞内表达较强的GFP荧光，病毒感染细胞后病毒的 mRNA正常表达，重组病毒中link序列、EGFP基因链接位置正常，证实 EV71-link-EGFP重组病毒拯救成功。重组病毒滴度的曲线峰值与野生型病