十四血清胆红素测定改良J-G法.DOC

实验十六 血清胆红素测定 （改良J-G法） 【目的】 熟悉血清胆红素测定的原理和方法； ２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。 【器材】 试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。 【试剂】 1．咖啡因试剂 称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。过滤后置棕色瓶，室温保存。 2．碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。 3．5g/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠0.5g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。 4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。 5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。 6．5.g/L叠氮钠溶液 7．胆红素标准液 （1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下： 收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小于0.04。 （2）配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在25℃条件下，光径1.000±0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系数应在60700±1600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74380±866。 （3）胆红素标准贮存液（171μmol/L）： 准确称取符合要求的胆红素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免产生气泡）。最后以稀释血请加至刻度。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4℃冰箱3天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。 【操作】 取试管3支，按下表操作： 表3-20 改良J-G法测定血清胆红素 加人物(m1) 总胆红素管 结合胆红素管 空白管 血清 0.2 0.2 0.2 咖啡因苯甲酸钠试剂 1.6 - 1.6 对氨基苯磺酸 - - 0.4 重氮试剂 0.4 0.4 - 混匀，准确1分钟 叠氮钠 - 0.05 - 咖啡因苯甲酸钠试剂 - 1.55 - 室温10分钟 碱性酒石酸钠 1.2 1.2 1.2 混匀，600nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。从标准曲线上查出相应的胆红素浓度。 【标准曲线制作】 取试管6支，编号，按下表操作： 表3-21 胆红素标准曲线的绘制 加人物(m1) 对照管 1 2 3 4 5 胆红素标准贮存液 － 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 稀释用血清 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 - 相当于胆红素浓度（μmol/L） 0 34.2 68.4 103 137 171 混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。每一浓度做3个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。 【正常参考范围】 血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L 血清结合胆红素（1分钟） 0～6μmol/L 【临床意义】 血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。总胆红素在17.1～34.2μmol/L时为隐性黄疸；超过34.2μmol/L时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性黄疸。 血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。溶血性黄疸时，血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的2