vero细胞无血清培养基培养技术与应用.docVIP

Vcro细胞是LI木学者Yasumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依 赖性细胞系，Vero—词由世界语屮的verde（意为绿色的）和reno意为肾脏的）两个词合卯而成。 Vero细胞是世界卫生组织和我国牛.物制品规程认可的疫苗牛产细胞系。与用作疫苗斗:产的 原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞甚质相比，Vem细胞具有以下特点:①来源方便， 可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、痫毒增殖滴度③遗传性状稳定，恶 性转化程度低，生物安全性较岛;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施人规模培 养。疫衍的接种对象主要是大范围的健庞人群，其质量和安企性一直是备受矢注的首要问题。 疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的牛产方式和过程。血淸是一种组分复杂而尚 不完全明确的混合物，至少含奋1 000种不同的缶白质，总缶白暈高达60?150g/L，它能为 细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受Vem细胞白身 的贴附依赖生L:特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，木世纪之前的Vcro细胞培养及 病诲疫fff生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其屮存在病谛等 病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫茁的生产工艺和疫馆质呈。从病毒疫苗生产工艺 角度考虑，血淸饥分的复杂性和批次间的质暈差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质 控制的难度;从病奇疫苗的安全性角度考虑，血淸中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状 脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。 由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定W素增加的现实M 题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随卷动物细胞无血淸培养技术的 不断进步，为包括Vero细胞迕内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必耍的技 术支擇，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美W、 欧盟和U本等发达国家将全而停止在生物制药中应用血淸，FDA将停止含血淸细胞培养工 艺生产的生物技术新药的中报受理。 Vero细胞无血淸培养基的研究和商业开发 1.1 Vero细胞无血清培养基的研究 培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最秉要的环境因素。 Vero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。 设计Vero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附牛 长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养难纟 11成成分。菽于细胞生长和代谢的高通fi分 析及Plackett-Burman实验没计和Box-Behnken响松/:面没计楚Vero细胞无血淸培养基没计和 优化的主要技术。Vero细胞的培养需要在适立的介质表而贴附、铺展冰开始有丝分裂、增 殖，病毐的冇效感染和增殖也冇赖于细胞的贴附生L；状态。此外，在某些病毐疫茁（如流感 病毒疫苗）的生产过程屮，需要在培养基屮加人一定浓度的胰蛋白酶以提高痫毒的感染和增 殖效率。另一方面，病靑的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞祸变、 以致凋亡和坏死、其至裂解的渐进性过程。Vero细胞无血淸培养基的没计和优化相对于应 用于动物细胞悬浮培养工艺生产秉组蛋0、特别足治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战 性。 设计Vero细胞无血清培养基的较为便捷和杏效的策略是以DMEM，F-12，M199和 RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和 代谢的主耍参数为评价指标，结合统计学方法确定昀其中添加生长W子、激素、结合蛋白及 豁附因子、微ft元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基屮常用的黏附因了 主要足存在于细胞间质和血淸中的胞外戒质（extracellular matrix,ECM）蛋白，如纤粘连蛋白、 S粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其屮，纤粘连蛋白和S粘连蛋白不仅ft有提高细胞的砧附 力及活力的作用，吋在促进有丝分裂中也起若軍:要的作用。菜些含有精氨酸-? U氨酸一天 冬氨酸（RGD）序列的短肤也能够舍效地促进Vero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材 料的介质表曲。 Vem细胞无血淸培养基的优化主要涉及以下两方面。—，从提高病毒疫苗安全性的 需要出发，以非动物來源成分替代动物來源成分、化学组分明确成分替代化学组分不确定成 分，其二，从提高病毐疫生产效率的R的考虑，根据细胞生长和代谢动力学特征优化培养 基的组成。 基因组学技术和蛋白质组学技术足近年來川于细胞培养研究的新工具，在分子水平对 细胞培养过程认识的深人，可以更准确地预测和判断体外培养细胞的生K和代谢状态。另外, 通过抗体芯什遴选参与细胞培养调控过程的细胞表面受体、黏附分子及信号通