过表达Smac对人胰腺癌MiaPaCaⅡ细胞的化疗增敏作用-内科学专业论文.docxVIP

目 目 录 中文摘要 l 英文摘要 O O 5 研究论文过表达Smac对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的化疗增敏作用 前言日IJ舌“ ··· ”””“一“””““““”······ ··· ··· 一“””””一““““”””······ ““““””” 。上·10一 材料与方法 O 0 12 结果 O O··· ·· ······· · ······· ·2l 附图、附表 0 O 25 讨{仑··········· ············ ······· O O 39 参考文献 4l 综述Smac在肿瘤进展中的研究现状 O O ．．·44 致调} ”一一”一 一．．．．“一““ ““” 一”一“““ 58 个人简历 59 中文摘要过表达Smac对人胰腺癌M 中文摘要 过表达Smac对人胰腺癌M i aPaCa-2细胞的化疗增敏作用 摘 要 目的：胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，恶性程度极高，预后 很差。由于早期诊断困难，胰腺癌手术切除率低，化疗、放疗亦无突破性 进展。分子靶向治疗是近年研究的亮点，但在胰腺癌治疗中无令人满意的 成果。Smac是一种存在于线粒体并调节细胞凋亡的蛋白，主要通过拮抗 IAPs对caspases的抑制作用，参与线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路， 促进细胞凋亡。以往研究发现在胃癌、膀胱癌、肺癌等多系统肿瘤中，Smac 高表达与肿瘤的发生、发展，肿瘤的分期、转移等密切相关，但关于Smac 在胰腺癌中的作用的研究很少。本研究通过构建Smac真核表达载体，观 察转染Smac基因对人胰腺癌MiaPaCa．2细胞的影响，探讨胰腺癌 MiaPaCa．2细胞过表达Smac对顺铂、吉西他滨有无增敏作用及其作用机 制，以期为胰腺癌的分子靶向治疗提供新依据。 方法： 1人胰腺癌MiaPaCa．2细胞、白血病K562细胞常规培养，MiaPaCa．2 细胞采用DMEM培养基培养，K562细胞采用RPMI．1640培养基培养。 2用逆转录．聚合酶链式反应(revers transcription PCR，RT．PCR)方 法从白血病K562细胞中获取细胞的cDNA。 3构建pEGFP．C1．Smac重组质粒：将pEGFP．C1和步骤2所获得的 PCR产物用HindlII及BamH I进行酶切，然后纯化。将纯化产物在16℃ 进行连接，连接3小时后将连接产物转化大肠杆菌DH5 Q，加入2×YT 培养基800I_tl，孵育60分钟，卡那平皿铺板，次日挑克隆。挑选阳性克隆 进行PCR鉴定，同时将扩增后产物纯化，送检测序。 4质粒的提取：用质粒小抽试剂盒从过夜培养的转化DH5 Q中提取 重组质粒DNA。 5 pEGFP．C 1一Smac重组质粒转染MiaPaCa．2细胞：将MiaPaCa．2细 胞分为3组，命名为未转染组、转空载体组和转Smac组，取对数生长期 细胞进行实验。将构建好的pEGFP．C1．Smac重组质粒在脂质体转染系统 作用下转染入转染组MiaPaCa．2细胞，将pEGFP．C1空载体在脂质体转染 中文摘要系统作用下转染入转空载体组MiaPaCa-2细胞，未转染组细胞未予处理， 中文摘要 系统作用下转染入转空载体组MiaPaCa-2细胞，未转染组细胞未予处理， 于转染24小时时于荧光显微镜下观察荧光蛋白表达强度。 6采用流式细胞仪(FCM)检测Smac转染24小时的细胞凋亡率、 细胞周期分布，再给予顺铂(8pg／m1)、吉西他滨(10pg／m1)作用24小 时后检测在顺铂、吉西他滨作用下Smac转染对MiaPaCa．2细胞的细胞凋 亡率、细胞周期分布和Survivin、Bcl．2蛋白表达的影响。 7采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测MiaPaCa．2细胞在顺铂 (899／m1)、吉西他滨(1099／m1)作用8、16、24、36、48小时各时段 的细胞生长抑制率，观察在顺铂、吉西他滨作用下Smac转染对各组 MiaPaCa．2细胞生长抑制率的影响。 结果： l质粒检测：pEGFP．C1．Smac重组质粒经PCR、测序鉴定，构建成 功。 2 pEGFP．C 1．Smac重组质粒和pEGFP．C 1空载体转染MiaPaCa．2细 胞，于荧光显微镜下观察可见，转染pEGFP．C1．Smac重组质粒的细胞自 发绿色荧光，表明Smac—EGFP绿色荧光融合蛋白在MiaPaCa．2细胞胞浆 内成功表达。 3细胞凋亡率变化：①转Smac组胰腺癌细胞的凋亡率(7．01±3．88)％ 高于未转染组(2．174-0．87)％，转Smac组细胞的细胞凋亡率高于空载体组 (4．40±1．49)％，差异均有统计学意义(Po．05)。而未转染组与空载体组 的细胞凋亡率差异无统计学意义。②顺铂作用24小时后转