过氧化氢酶对肠上皮细胞的保护机制的研究-内科学(消化系病)专业论文.docxVIP

博士学位论文过氧化氢酶对肠上皮细胞 博士学位论文 过氧化氢酶对肠上皮细胞 的保护机制的研究 博士研究生：王群英 指导教师：张亚历教授 王继德副教授 摘萼 肠上皮细胞是肠黏膜屏障组成中最重要的细胞成分，肠黏膜屏障遭到破坏 时伴随着氧活性物质(ROS)的增加，ROS作为细胞内第二信使可以激活多种 转录因子，调控致炎细胞因子和化学因子的过度表达，加重肠黏膜屏障功能的 损坏。过氧化氢酶作为ROS的清除剂可以使过氧化氢分解为水和氧，减少肠黏 膜内ROS的数量，减弱ROS的第二信使作用，从面起到保护肠黏膜的作用。我 们在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，np)致病性的研究中，克隆纯化了该菌 的过氧化氢酶(rHpCat，已申报专利)，意外地发现在我们的表达系统中该酶的 活性远高于目前普遍应用的购自Sigma公司的纯化牛肝过氧化氢酶。在本课题 中，我们通过建立溃疡性结肠炎动物模型，从体内、体外实验系统评价商品化 的过氧化氢酶和幽门螺杆菌过氧化氢酶对肠上皮细胞内细胞外信号凋节激酶 (ERK)、核转录因子r,B(NF．KB)的激活、炎症介质和化学介质的释放、肠上 皮细胞的凋亡等的作用。 一、过氧化氢酶对LPS诱导SW480细胞应激反应的保护作用及机制研究 应用肠癌细胞株SW480细胞，以脂多糖作为刺激因素，过氧化氢酶阳性克 隆株在LB培养液(含100肚g／ml氨苄青霉素)中37℃培养过夜，然后按l％转接 至含氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至OD值为0．6～0．8，加IPTG至终浓 度为0．1mmol／L，诱导表达3h，离心收集菌体，冷PBS沈2遍，按照菌体湿重与 牛肝CAT的活性比，加入适当的PBS重悬，冰浴超声粉碎后，离心取上清进行 实验。将对数生长期的细胞随机分为正常对照组、脂多糖(LPS)组、幽门螺剌· 菌过氧化氢酶(np．CAT)预孵组、幽门螺杆菌过氧化氢酶(王啦一CAT)处理组、 牛肝过氧化氢酶(牛肝一CAT)预孵组、牛肝过氧化氢酶(牛肝一CAT)处理组。 中文摘要J卜常对照组不加任何处理因素，其它5组均加入LPS，浓度为100ng／ml。牛盯 中文摘要 J卜常对照组不加任何处理因素，其它5组均加入LPS，浓度为100ng／ml。牛盯 CAT预孵组在加入LPS前30min加入浓度为200U／ml的牛肝CAT，牛肝CAT 处理组则在加入LPS同时加入浓度为200U／ml的牛肝CAT，^咖一CAT预孵组和 处理组加入相当于同等活性的收集上清，处理方法同前。孵育30rain后5组同 时终止。 1、过氧化氢酶对SW480细胞凋亡的影响应用Annexin V-FITC细胞凋亡检 测试剂盒，采用流式细胞术检测过氧化氢酶对细胞凋亡的影响，应用透射电镜 观察过氧化氢酶对细胞凋亡和线粒体的影响，结果发现；LPS组较正常对照组的 细胞凋亡百分数明显增加(P0．01)，而CAT预孵组凋亡百分数较LPS组和 CAT处理组则明显减少(P0．05)。LPS组和CAT处理组之间无明显差异．各 CAT预孵组和处理组之间也无明显差异。此外，LPS组和CAT处理组的细胞内 线粒体明显肿胀，可以观察到典型的凋亡细胞，而预孵组的细胞内线粒体发生 轻微肿胀，未发现典型凋亡细胞。上述结果说明，经过CAT预孵后，可以明显 抑制细胞的凋亡，保护线粒体。 2、过氧化氢酶对SW480细胞内致炎细胞因子TNF-啦、IL-lp、IL-8和cox．2 表达的影响应用RT-PCR技术对SW480细胞内细胞因子TNF-a、IL-ID、IL一8 的mRNA表达水平进行检铡，结果显示：所有处理组TNF一“、m一1B、IL一8的表 达水平均较正常对照组明显增高(P0．01)，但各CAT预孵组的表达较LPS组 和CAT处理组表达明显减少(P0．05)，LPS组和各CAT处理组之间无明显差 异。免疫细胞化学和Western blot分析发现，LPS刺激后所有处理组COX一2的 蛋白表达较正常对照组明显增加，但各CAT预孵组的表达较LPS组和CAT处 理组明显减少(PO．05)，LPS组和各CAT处理组之间无明显差异。上述结果 表明：过氧化氢酶对TNF-a、Ⅱ，16、IL一8的mRNA表达有明显抑制作用，对 COX一2的蛋白表达办有明显抑制作用。 3、过氧化氢酶对SW480细胞信号转导通路的影响应用免疫细胞化学方法 观察NF．r,B在细胞核内的分布，Western blot分析胞质内IrB的降解，同时臆 用EMSA的方法检测NF．v,B的激活，结果发现：LPS刺激后NF—r,B被明显激 活，从细胞核外转移到细胞核内，胞质中Ir,B也明显降解。但各CAT预孵组的 NF—r,B的移位和IKB的降解较LPS组和cAT处理组明显减少，NF—KB的激活也 明显减少，LPS组和各CAT处理组之间无明