哈维氏弧菌寡肽透性酶原核表达、突变株构建及其性质研究-微生物学专业论文.docxVIP

、 、 ＼姻、刺,,t926998 哈维氏弧菌寡肽透性酶原核表达、突变株构建及其性 质研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 、触飞 莎 却 飞／、 答辩委员会成员签字： ‘～ 一。 ^ 彤．7，V 刁． ＼移留‘ 兰麟 独创声 独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 (注!翅逡直墓熊壶要挂型虚明鳆!奎拦要窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：镌庆笏 签字日期：弘‘f年岁M日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： l、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：{匾吞：豸 导师签字： ‘专彩许 签字日期：妒。、年S月以日 签字日期：侧(年婿L『日 哈维氏弧茵寡肽透性酶原核表达、突变株构建及其性质研究摘 哈维氏弧茵寡肽透性酶原核表达、突变株构建及其性质研究 摘 要 哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，是发光弧菌的主要成员之一。在海洋环境 及鱼、甲壳类和无脊椎动物等海洋动物中广泛存在。许多国家爆发的大规模性对 虾死亡及中国和南亚一些国家报道的鱼的致病都跟哈维氏弧菌有关。 一些革兰氏阴性菌例如大肠杆菌有三套肽转运系统，以帮助它运输多种底 物，满足其对氮源宽泛的需求。这三个系统为二肽透性酶(Dpp)，三肽透性酶(Tpp) 和寡肽透性酶(Opp)。寡肽转运系统属于ABC型转运家族全转运蛋白型，由5个 亚基组成：1个胞外寡肽结合蛋白(oppA)，它负责与进入细胞的底物特异性地结 合，将其传输给转运蛋白(translocator)；形成运输通道的2个跨膜蛋白 (oppB／oppC)；2个核酸结合区(oppD／oppE)。它是一个溶质结合蛋白，不仅为细 菌生长提供碳源和氮源，还参与胞内信号传导。越来越多的证据显示ABC型转 运蛋白与细菌的致病性相关。 从哈维氏弧菌SF一1基因组中用PCR扩增得到特异性片段，含寡肽结合蛋白 基因，该基因全长1665 bp，编码554个氨基酸。以哈维氏弧菌SF—l基因组DNA 为模板，将扩增的基因片段与克隆载体pMD．19T连接，构建重组质粒并测序， 序列分析发现与创伤弧菌，副溶血弧菌，河弧菌等的寡肽结合蛋白具有很高的相 似性；将目的片段与表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒，将其转入大肠杆菌 BL21；经IPTG诱导表达，用镍亲和层析纯化重组蛋白，SDS．PAGE检测发现破 碎的菌体和上清中均表达出大小为58 kDa左右的目的蛋白。 纯化的重组寡肽结合蛋白具有磷脂酶C活性和溶血活性。蛋白磷脂酶C活 性的最适温度为55℃，当高于46℃时，酶活力急剧下降。在66℃时，磷脂酶 的活力几乎全部丧失。酶的最适反应pH值为8．0，在pH为7．0时，酶活力比较 稳定。将纯化的蛋白注射斑马鱼，导致鱼的死亡，鱼鳃部和腹部均有出血现象， 表明该蛋白具有致病性。 扩增寡肽透性酶基因ORF 97．604区间507 bp的片段，连接克隆载体 pMD。19T，并连接自杀质粒pNQ705，利用同源的方法构建寡肽透性酶基因突变 株。野生株与突变株在正常培养条件下生长状况没有明显差异。运用Western blot 检测发现突变株中寡肽透性酶的表达量远远低于野生株，野生株对斑马鱼半数致 检测发现突变株中寡肽透性酶的表达量远远低于野生株，野生株对斑马鱼半数致 死量为3．1lxl04 CFU／g，突变菌株的LD50为5．46x105 CFU／,尾，表明突变株的 毒性降低。 关键词：哈维氏弧菌；寡肽透性酶；表达；性质；磷脂酶C；溶血性；突变；致 病性 Expression，characterization，and Expression，characterization，and mutant construction of oligopeptide permease from Vibrio harveyi Abstract Vibrio harveyi is a Gram—negative bacte