PCR聚合酶链式反应.pptVIP

PCR反应程序 95℃ 5min 1个循环 95℃ 30sec 35个循环 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 10min 1个循环 4℃ hold ? 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 章PCR技术原理 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。 PCR技术: PCR概念的提出 1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1983，Kary Mullis 1993年获得诺贝尔奖 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 技术难点 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。 thermus aquaticus Taq DNA聚合酶的发现 1988年Saiki 等从温泉（?Hot?spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在?1989?年，Science?将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子?(Molecule?of?the?year) Taq DNA聚合酶优点 1、PCR技术的基本原理 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 PCR技术的基本原理和工作方式 模板DNA 95℃ 2.PCR工作方式 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 3.PCR基本材料 ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 4.PCR反应程序 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’(按1’扩增1kb计算）延伸 ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存 ⑸ 25-35个循环 5.PCR要素解析 1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3 ℃ ）。 延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。 2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模