RNA干扰技术基本原理与应用培训课件.pptVIP

RNAi的主要特点和优势 诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的效率非常高 可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化” * siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 共同点 特异性 靶向性 * siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 不同点 独特的双链结构 需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同因子 siRNA 本身无催化活性 在细胞内可能具有相对的稳定性 具有一定的可遗传性 * RNAi的主要过程 启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA 长度：21-25nt 结构：3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU * 细胞中内源性dsRNA的形成 基因组中DNA 反向重复序列的转录产物 同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体 以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA * Dicer酶 RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA 广泛存在 * RdRp（RNA dependent RNA polymerase） 使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNA * RNAi的主要过程 效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 siRNA、核酸内切酶、外切酶和解旋酶 RISC的激活：ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下，RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基因表达失活 * * RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则 序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始 从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点 不要针对5‘和3’端非编码区（untranslated regions，UTRs) * RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则 设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列 * 阴性对照序列的设计 特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG 在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG * 目标序列筛选的相关网站 /Stu/shilin/rnai.html /sirna.pl /rnai/ http://RNAiD /rnaidesigner/ :9331/RNAi/html/rnai.html  * 查找已经证实的siRNA的网站 /catalog/category.aspx?key=49 /techlib/tb/tb_502.html /mmcmanus/www/siRNADB.html /Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published * siRNA的制备方法 体外制备方法 化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成siRNA * 化学合成法制备siRNA 优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点：价格昂贵、合成周期长 用途：已经找到最有效的siRNA的情况下， 需要大量siRNA进行研究 * 体外转录法制备siRNA 优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制 用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs * * 消化法（ “ siRNAs 鸡尾酒 ”） 优点：无需检测或筛选多个siRNA序列 产生多种 siRNAs 混合体，保证有效的 目的基因沉默 缺点：有可能引发非特异的基因沉默 用途：快速而经济地研究某个基因功能缺失 的表型 * * siRNA的制备方法 细胞内制备方法 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA 通过PCR介导的siRNA表达