西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2016,49(17):3359-3369 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.17.010 西瓜抗枯萎病相关基因 ClMYB 转录因子的克隆及表达分析 韩金桓，王丽霞，高洪波, 吕桂云 （河北农业大学园艺学院，河北保定071001 ） 摘要：【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB 转录因子，进行生物信息学及表达模式分析，为进一步解 析 ClMYB 在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和 Microarray数据分析，获得与西瓜抗枯萎病相关的基因 ClMYB，采用RT-PCR技术分离克隆ClMYB cDNA全长序列； 应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征；使用 MEGA5.0 对 ClMYB 蛋白序列及其同源序列进行多 序列比对，并构建同源物种间系统进化树；采用 GFP 标记的方法进行亚细胞定位，分析编码蛋白表达位置；将该 基因片段通过 Nde I 和 Xba I 双酶切连接至原核表达载体 pCzn1，重组质粒转化至大肠杆菌 Arctic Express，经 终浓度为0.5 mmol·L-1 IPTG诱导4 h，用SDS分析融合蛋白的表达；利用实时荧光定量PCR 方法检测目的基 因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸（jasmonate，JA）诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR 方法从西瓜野 生材料 PI296341-FR 根系组织中克隆该基因片段（GenBank：KT751229），序列比对及生物信息学分析表明，其基 因编码的氨基酸序列具有MYB 转录因子R2R3型的典型特征，其N端具有R2、R3两个MYB 结构域，C端高度变异。 多序列比对及进化树分析表明，该基因编码的蛋白与甜瓜 MYB （GenBank：XM_008440304）和黄瓜MYB （GenBank： XM_011652633）同源性最高，其编码的氨基酸一致性达到 86%，这与它们同属葫芦科植物有关；亚细胞定位显示 ClMYB定位于细胞核，为典型的转录因子；成功构建了该基因的原核表达载体pCzn1-ClMYB，转化至大肠杆菌得到 36 kD左右蛋白；ClMYB 受枯萎病菌诱导，在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中，相对感病品种表达量高峰出现的 早，且表达量高。50 μmol·L-1 的MeJA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平，同时诱导 ClMYB 表达，与抗病材料 PI296341-FR 相比表达趋势一致，但表达量更高。【结论】ClMYB 为典型的 R2R3-MYB 转 录因子，亚细胞定位于细胞核中；基因的原核表达得到 36 kD 的融合蛋白，在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸 诱导，推测 ClMYB 可能参与JA 介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路，在西瓜抗病中起一定的作用。 关键词：西瓜；枯萎病；ClMYB 转录因子；基因克隆；表达分析 Cloning and Expression Analysis of Fusarium Wilt Resistance- Related Gene ClMYB Transcription Factor from Citrullus lanatus HAN Jin-huan, WANG Li-xia, GAO Hong-bo, LÜ Gui-yun (College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei) Abstract: 【Objective 】The objective of this study is to clone ClMYB, which is a gene encoding