第四章 抗体制药.pptVIP

免疫融合蛋白基因表达可用真核细胞，也可用原核细胞表达（分泌/包含体表达）。 基因工程抗体与IL-2的融合蛋白能特异定位于肿瘤局部，减少对周身的不良反应。 CTLA4-Ig的应用： T细胞活化需要两个信号，只接受第一个信号时，并不产生活化，而是进入无反应状态，甚至导致程序性死亡，许多分子参与第二信号的传递，其中B7和CD28/CTLA4被认为是最重要的共刺激分子。 CTLA4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）位于T细胞表面，为B7受体，与B7的亲和力是CD28的20倍。 CD28与CTLA4的功能有着明显的差别：在有第一信号存在的情况下，B7与CD28结合后，共刺激信号传递给T细胞，产生正常的免疫应答；而B7与CTLA4结合后，则对T细胞的免疫应答起负性调节作用。 CTLA4-Ig是由人CTLA4分子的胞外区，与人的IgG1的恒定区CH2和CH3区融合而成的可溶性嵌合蛋白，可与人/大鼠/小鼠的B7分子结合。 CTLA4-Ig是一种高效/无毒并兼有免疫抑制和诱导免疫耐受的生物免疫抑制剂，对移植排斥的防治和一些自身免疫疾病的治疗具有广阔的应用前景。 第五节 抗体工程 抗体研究的沿革 ①多克隆抗体 1890年~1975年，是用抗原免疫动物，获得多克隆抗体 ②单克隆抗体 1975年~20C 90Y，以杂交瘤技术制备单克隆抗体 ③以基因工程方法制备抗体 基因工程技术制备；以1994年Winter创建噬菌体抗体库技术为代表 基因工程抗体不用人工免疫动物和杂交瘤技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动、植物大规模生产抗体，并在此基础上发展成抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1.获取目的基因 提取mRNA，经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段（如VH和VL），抗体基因的组合形式多为单链抗体， 2.抗体库技术的载体 目前应用最多的是噬菌粒（质粒-噬菌体），它具有噬菌体和质粒的共同特点；转化效率高，抗体基因文库容量大 3.淘筛 抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增 4.表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程 二、噬菌体抗体库的分类 （一）按抗体基因的性质分 1. DNA文库 2. cDNA文库 （二）按抗体基因的来源分 1．天然抗体库(native antibody library) 2．免疫抗体库 3．半合成抗体库 4．全合成抗体库 三、噬菌体抗体库技术的特点 1.模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到1011库容，可包含B细胞的全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA ，抗体的VH和VL 基因进行随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然全套抗体库 2.避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以“挑出”任意的抗体基因，因而免除了人工免疫和细胞融合 3.可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中， VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲合力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此所产生的抗体必然都是高亲合力的人源化抗体 四、基因工程抗体的表达 1.原核生物 融合表达和分泌表达2.真核生物 如酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞等，都是分泌表达3.转基因植物 烟草叶中的表达（植物抗体）4.转基因动物 单基因水平，还处于研发阶段 五、 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 六、基因工程抗体的表达 1、原核细胞表达：融合表达，分泌表达。 2、真核细胞表达：酵母，昆虫细胞，CHO，真菌等 3、转基因植物表达：烟草，拟南芥 4、转基因动物表达：转基因鼠 可不经过免疫，利用抗原从库中直接筛选出特异性抗体，获得抗体的时间短，可大量生产，特别是能直