第五章 抗体制药.pptVIP

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 接头DNA VH VL 图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 ⒈获取目的基因 ⒉抗体库技术的载体 ⒊淘筛 ⒋表达与鉴定 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 2.体外培养法-目前工业化生产常用方法 动物细胞培养技术发展非常迅速，越来越多用于单克隆抗体的生产。 生产工艺易控制，对于保证产品的品质很重要。 目前常用的方式有两种：悬浮培养和细胞固定化培养 六、单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 1离心 取上清，超滤，盐析。 2分离 ⑴凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析 IgG单抗纯化。 第三节 基因工程抗体及其制备 杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。 目的：降低免疫源性；降低相对分子量。 人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。 基因工程抗体的优点： 1.最大成度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应 2.分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位 3.可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体 4.可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量生产，大大降低成本。 一、人鼠嵌合抗体 抗原抗体结合功能—抗体可变区（V） 同种性免疫源性—抗体稳定区（C） 在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。 Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL 免疫球蛋白 基因载体的构建 H链嵌合载体 L 链嵌合载体 共转染细胞 启动子 人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠VH 鼠VL 人CL 人CH 抗体分泌细胞 人-鼠嵌合基因工程抗体 二、改形抗体（CDR移植抗体） Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。 H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体（改型抗体） 图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植） 三、小分子抗体-Fab, Fv 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig 分子中的C区不表达。 小分子抗体类型有： 　①Fab片段抗体 　 ②Fv抗体 ③单链抗体 ④单域抗体 ⑤最小识别单位 单链抗体的优点： 1.可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 2.易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。 3.免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。 4.在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 5.易于与毒素或