广谱治疗性肿瘤疫苗开发的临床前期研究-分子免疫学专业论文.docxVIP

广谱治疗性肿瘤疫苗开发的临床前期研究学生：钟宇新 广谱治疗性肿瘤疫苗开发的临床前期研究 学生：钟宇新 中国协和医科大学医学94级 导师：赵平教授 中国协和医科大学肿瘤医院腹部外科 孙宗棠教授 中国协和医科大学肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室 摘要 目的：利用树突状细胞(DCs)强大的佐剂能力以及突变的p53蛋 白在许多肿瘤患者体内高度积累的特点，开发具有治疗功效的治疗 性肿瘤疫苗的临床前期研究。采用249密码子突变的p53基因转染 体外增殖获得的自体DCs的方法，将可以解决瑚C配型限制的问 题，使得开发出的治疗性肿瘤疫苗具有更为广泛的临床适用性。有 充足的DCs来源可供多次注射，将会最大限度地增加获得抗肿瘤免 疫反应的可能性。 ／材料及方法： 采用PCR及HaeIII／限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)的方法，对已知含有高频度密码子突变的p53基因的中国 启东肝细胞癌病理标本进行研究，分析其DNA中249密码子突变 型所占的比例。将肝癌标本进行免疫组织化学染色后，对其进行仔 1 中国挤和医科大学博士学位论文细的研究，观察在癌细胞与非癌肝细胞中p53蛋白的积累情况。构 中国挤和医科大学博士学位论文 细的研究，观察在癌细胞与非癌肝细胞中p53蛋白的积累情况。构 建了一个重组体，其中插入有一段片段长度为1．8kb的249密码子 突变的p53基因，并通过DNA测序的方法对其进行鉴定。将脐带 缸中的单个核细胞经体外定向增殖培养获得DCs，对其转染突变型 的p53基因，利用相关的单克隆抗体，通过FACS的方法对DCs中 的p53蛋白以及一些DC自身的表型标志进行检测。送检DC的培 养上清液，证实其并未受到细菌、霉菌以及支原体的污染。 结果： 1．特征性的RFLP结果证实了在启东HCC DNA中存在有249密码 子arg／ser突变的p53基因(249ser—p53)。免疫组织化学染色的 结果显示，突变的p53蛋白在绝大多数肝癌细胞中大量并且高度 特异性地积累，而在其周围的非癌肝组织细胞中却无任何积累。 2．重组体的DNA序列分析结果证实，该重组体中正确地插入了与 标准序列具有高度同源性的突变型p53基因。 3转染后，人树突状细胞中出现了249set-p53蛋白的积累。经过转 染的DCs仍然能够正常分化，并且完全能够表达其自身的表型 分子。 4检测结果证实，DCs培养液中未见细菌或霉菌污染；支原体污染 与否目前尚在检测中，等待结果回报。 5．对该疫苗是否能够诱导CTL反应的研究目前正在进行中，预计 将会获得阳性的结果，从而推动这种疫苗迅速进入到临床实验阶 中国挤和医科大学博士学位论文结论： 中国挤和医科大学博士学位论文 结论： 1 249ser．p53蛋白在肝细胞癌细胞中大量并且高度特异性地积累， 而在其周围的非癌肝组织中却无任何积累，该现象提示，这种蛋 F1具有能够提供丰富的以p53为基础的I类及II类抗原表位来源 的重要能力。 2．249ser．p53蛋白在人树突状细胞中有相对较高水平的积累。由 于p53突变是一种常见现象，同时自体同源系统克服了MHC限 制的局限性，因此，必将使得这种疫苗具有更为广泛的适用性。 3 基于上述情况，目前正在进行的研究工作，必将能够推动这种 治疗一瞄箔疗性肿瘤疫苗在不远的将来就会进入到临床实验阶 段。 泛键例、 闰中瘤， 肝≤团月色獗，免癌组织亿学， 中国协和医科大学搏士学位论文Abstract 中国协和医科大学搏士学位论文 Abstract Objective：To accomplish the pre～clinica]studies for developing a therapeutic cancer vaccine by utilizing the strong adjuvant capacity of dendritic cells(DCs)as well as by taking advantage of the high accumulation of mutated p53 protein in many human cancers．Transfection of 249 codon mutated p53 into autologous DCs grown in vitro，preferably from leukopak，may solve the MHC restriction issue and further broaden the vaccine’S clinical applicability．SuffiClent source of Des for multiple boosters to maximize the possible im