实验二--原代细胞培养模板.pptVIP

1. 仪器与备品：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、 小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血细胞计数板、离心机、水浴箱（37℃）。 2.?材料：胎鼠或新生鼠。 3.试剂：1640培养基（含10%）小牛血清）、0.25%胰 蛋白酶、Hank，s液、碘酒、75%的酒精。 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 5.待组织变得疏松，颜色略微发白时，加入3～5ml培养液（含10%小牛血清）以终止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）； 6.把消化后的悬液转移到有纱布的小玻璃漏斗上,过滤后的溶液放入离心管中,1000r/min离心8min弃上清液； 7.?加入Hank，s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上液； 8.?加入培养液1～2ml（视细胞量），细胞计数板计数； 9.将细胞调整到5×105个细胞/ml左右，转移至10ml细胞 培养瓶中，37℃条件下培养。 1.自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2.??在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3.??凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 4.??操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%的酒精擦拭。试剂等瓶口也要擦拭。 5.?点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不要太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具能再烧灼，以免烧焦变成碳膜。 6.??操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防止空气流动，增加污染机会。 7. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 8.? 瓶子开口后要尽量保持45o斜位。 9.? 吸溶液的吸管等不能混用。 * 目的与要求 实验二 原代细胞培养与观察 掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 实验用品 原 理 实验步骤 （一）胰酶消化法 将孕鼠或新生小鼠引颈处死，置75%酒精泡2～3min（时间不能过长，以免酒精从口和肛门进入体内），再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带进工作台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肾脏，置平皿中； 2.?取Hank，s液洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物； 3.?用手术剪将肾脏剪成小块（1mm2），再用Hank，s液洗三次，转移至离心管中； 4.视组织块量加入5～10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化20min，每隔5min震荡一次，使细胞分离； 实验步骤 注 意 事 项 *