发酵工程在现代生物技术中的应用.pptVIP

第八章 发酵工程在现代生物技术中的应用 第 一节 基因工程菌的发酵 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 （一）工程菌的稳定性 1、基因工程菌不稳定的表现 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。 基因的不稳定性原因： 质粒分离丢失、 结构不稳定性 表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变） 1、培养基 培养基给重组菌提供必需的营养和适宜的环境，对重组菌的生长、质粒的稳定及产物的表达有极其重要的影响，同时还要考虑到目的产物的提取和纯化工艺。 人畜的蛋白质发酵 营养丰富容易质粒丢失 3、比生长速率 基因工程菌在培养过程中的比生长速率与重组产物的表达速率存在一定的关系，过高或过低的比生长速率均不利 (三)、安全问题 关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。 1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 第二节 动、植物细胞大规模培养 动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 一、细胞融合技术 细胞融合技术（cell fusion technology)，是指两个或更多个亲本细胞经酶法出去细胞壁得到两个球状原生质球，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合形成单个细胞，获得新的重组子的过程。 （一）原生质体的制备 影响原生质体制备的因素： 1、亲本的选择及预处理 微生物细胞——取对数期细胞，培养基中加入细胞壁合成抑制剂，可以增加菌体对脱壁酶的敏感性 植物细胞——一般选择活跃生长器官和组织细胞，由此制得的原生质体生活力较强，再生分化比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶 2、除壁酶的选择 细菌放线菌用溶菌酶处理 酵母菌用蜗牛酶处理 霉菌用几丁质酶和纤维素酶配合 植物细胞一般用混合酶 3、酶浓度 酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，酶浓度过低不利于原生质体形成，酶浓度过高则导致原生质体再生率的降低 4、酶解温度 20~40℃ 5、酶解时间 酶解时间过长，原生质体再生率降低 6、渗透压稳定性 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压下才能维持 （二）原生质体融合 融合是把两个亲本原生质体混合在一起，通过诱导融合作用使原生质体发生融合。 1、生物学法 主要用于动物细胞融合 该法由于病毒的致病性和寄生性，制备比较困难，诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不高，近年 不多用 （三）原生质体再生 原生质体失去了细胞壁，是失去了原有细胞形态的球状体，原生质体再生必须使用再生培养基，再生培养基由渗透压稳定剂和各种营养成份组成 （四）融合子的选择 融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。 二、动植物细胞大规模培养技术 自学 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972