过量合成核黄素重组枯草芽孢杆菌的构建-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 以GTP与核黄素合成代谢去调控的突变型原核微生物作为受体菌，构建过 量合成核黄素的基因工程菌，用于核黄素的工业发酵，是核黄素工业产生的新技 术c增加核黄素操纵子在细胞中的基因剂量，提高其编码酶的表达水平，是构建 核黄素发酵基因工程菌的基本手段。 本文以质粒pMX45为模板，PCR扩增了枯草芽孢杆菌4．6Kb的，硒操纵子。 该片断分别与Ecoli-B subtilis穿梭载体pBE2和pHPl3连接，构建了重组质粒 pBE2R和pHPl3R；与穿梭载体pDG364和pd01664连接，构建了重组质粒 pDG364R和pDGl664R。重组质粒分别转化DH5a，进行了扩增和酶切鉴定。 以枯草芽孢杆菌DBl04染色体为模板，PCR扩增了1．5Kb的recA片断， 与pBE2连接得到重组质粒pBE2一REC，转化B subtilis24筛选出recA+的转化子 B subtilis 24R，其核黄素合成能力为】100mrg／l。同时筛选最subtilis 24与且subtilis DBl04的原生质体融合子，得到recA+的融合子B subtilis RH，能够积累440rag／／ 的核黄素。 重组质粒pBE2R、pHPl3R、pDG364R和pDGl664R分别转化B subtiIis 24R 和RH，除pBE2R得不到稳定的转化子外，其余转化得到了一系列转化子。核黄