第7章章节微生物遗传.pptVIP

* * 第五节 微生物原生质体融合技术 一、动物多核细胞的发现和原生质体技术的建 二、微生物原生质体制备技术三、微生物原生质体融合四、微生物原生质体的其他用途 动物多核细胞的发现原生质体融合技术的建立 19世纪初，人们发现动物多核细胞现象。 后来研究发现多核动物细胞的产生往往与病毒感染有关。20世纪中叶，人们用病毒诱导离体条件下动物细胞的融合。 1838 Muller 动物病理组织中发现多核细胞 1873 Lugmbuthl 天花病脓胞周围发现多核细胞 1896 Unna 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 1931 Wathin 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 1954 Bnders et al 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 1958 Marston 用副流感病毒诱发细胞融合 1970 Power et al 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 1972 Carlson 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 1972 Ferenczy et al 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 1974 Michayluk 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 1976 Ferenczy et al 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 1976 Fodor et al 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 1977 Hopwood 链霉菌原生质融合并获融合重组子 1978 Gleba et al 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 1981 Menczel 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 1988 Kirimalra et al 原生质体融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株PEG 原生质体研究的发展 原生质体 (protoplast) 植物、大多数微生物细胞具有细胞壁。采用一定方法技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。 原生质体融合 原生质体融合包括： 原生质体制备、 原生质体纯化 原生质体融合 融合子检出 融合子鉴定 ①超声波处理菌体释放原生质体②酶解脱壁释放原生质体 目前多用酶解法 微生物原生质体制备 放线菌的细胞壁 二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 微生物细胞壁的组成 细胞壁的组成 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要根据微生物种类特性选择合适的酶。 细菌细胞壁的结构 G+ 糖肽、底聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸、脂多糖  G- 糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白 种类 纤维素 几丁质 其它多糖 疫霉属 25 0 65 毛霉属 0 9 44 酵母属 0 1 60 镰刀菌属 0 39 29 裂褶菌属 0 5 81 鬼伞属 0 33 50 真菌的细胞壁成分 自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蜗牛消化道中的消化液中酶类，寄生性微生物合成的有关酶。处理细菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme处理放线菌细胞壁用酶 Lytic Enzyme裂解酶、 Lysozyme溶菌酶 制备微生物原生质体的酶 纤维素酶 Cellulase 酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶几丁质酶 Chitinase商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶  Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast) 处理真菌用酶 ①酶种类选择 单一酶的组成②酶浓度  酶浓度应合适，浓度太高对原生质体有破坏作用，影响原生质体的再生。 lysozyme常用浓度0.1~0.2 mg/ml glucuronidase 1％