生物工艺学第2章--基因工程工具酶1.pptVIP

基因工程工具酶及其应用 限制性核酸内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA连接酶—用于DNA和RNA的连接 DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 一??? . 限制性内切酶的概念 核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。 Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus) ?来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 ?结构：单亚基 MW = 94,000 d。 ?活性：聚合最适温度为 75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性 。 ?用途： PCR 反应。 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。 末端转移酶 (不依赖模板的 DNA 聚合酶) ??来源：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的 DNA 聚合酶 (Chang 和Bollum,1986)。 ??结构 ：MW = 60,000 d. ??活性：催化 dNTP 掺入 DNA 3′-OH 末端，形成同聚物末端；反应不需模板 DNA，需 Co2+ 用途： 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记 反转录酶(reverse transcriptase) 来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)。 来自能表达 Moloney 鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的 E.coli。 结构和活性： + + 84，000 M-MLV +++ + α62，000 β94，000 AMV RNAseH 5’-3’聚合活性 肽链 酶类别 ?用途： 对 RNA:DNA 杂交体中的 RNA 特异性地降解，免除了在反转录完成后再用 NaOH 降解 RNA 模板的步骤。 来源 T7、T3RNA 聚合酶在 E.coli （或细菌）中的克隆表达。 E.coli RNA 聚合酶。 活性：在 DNA 指导下合成 RNA，结合于启动子部位，转录无意义链 (一) 产生与有意义链相似 (以U代替模板中 T) 的链。 转录链为无意义链，负链 (-)。  不转录链为有意义链，正链 (+)。 RNA 聚合酶（RNApolymerase） ?磷酸激酶催化 5’-OH 加 P （标记） ?和磷酸酶去除 5’- P （防止自身环化） PNKase PMase 5′HO A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C OH 5′ 多核苷酸激酶 磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase 5′p A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C p 5′ 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶（nuclease） ? Bal13 核酸酶 从 DNA 末端同时降解两条链。 用于基因表达调控序列的研究。 S1 核酸酶 降解单链核酸。 用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端 的 DNA。 在 DNA 部分变性条件下，能在富含 AT 区切断 DNA。 （3）识别位点及邻近位点特异性序列 如：pBR322 DNA 有 4个 NarⅠ切点 (GGCGCC)其中 2 个切点用1U 酶水解 1h 完全切开, 2 个切点用50U 酶水解 16h 水解不完全。 XmaⅢ 切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。 （4）DNA 二级/三级结构 如：超螺旋 DNA (病毒或质粒) 比线状 DNA 需酶多 （5）提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度 Hg2+、酚、 氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl 等。 2.反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：Ⅱ型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 限制性核酸内切酶的反应条件 3. 星活性