油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位-中国油料作物学报.PDF

中国油料作物学报 ２０１８，４０（３）：３０９－３１７ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ ｄｏｉ：１０．７５０５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－９０８４．２０１８．０３．００１ 油菜乙酰乳酸合酶基因ＢｎＡＬＳ３的 亚细胞定位、原核表达及其酶活分析 胡茂龙，龙卫华，高建芹，陈　锋，周晓婴，张　维，陈　松，张洁夫，浦惠明 （江苏省农业科学院经济作物研究所／农业部长江下游棉花与油菜重点实验室／ 国家油料作物改良中心南京分中心，江苏 南京，２１００１４） 　　摘要：为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因ＢｎＡＬＳ３的亚细胞定位与酶学特性，以甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．） 品系Ｎ１３１为材料，采用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆到ＢｎＡＬＳ３的ｃＤＮＡ序列。该序列含有一个长度为１９５９ｂｐ的开放阅读 框，编码蛋白为６５２个氨基酸，在Ｎ端含有一个由４９个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构 建至植物表达载体３５Ｓ：：ＢｎＡＬＳ３－ＧＦＰ，利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达，结果显示ＢｎＡＬＳ３蛋白定位在叶 绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的ＢｎＡＬＳ３原核表达载体ｐＣｚｎ１－ＢｎＡＬＳ３，转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行诱 －１ 导表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测显示，在１１℃条件下以终浓度为０．２ｍｍｏｌ·Ｌ 的ＩＰＴＧ诱导８ｈ后，ｐＣｚｎ１ －ＢｎＡＬＳ３基因在大肠杆菌中成功表达，融合蛋白Ｈｉｓ－ＢｎＡＬＳ３呈部分可溶性，分子量约为６７ｋＤ。酶活分析表明， 原核表达的Ｈｉｓ－ＢｎＡＬＳ３最适反应ｐＨ值为７．０，最佳反应温度为３７℃，酶学常数Ｋ 值和 Ｖ 值分别为６．５５ｍｍｏｌ ｍ ｍａｘ －１ －１ －１ ·Ｌ 和６．４０ｍｏｌ·ｍｇ ·ｈ 。 μ 关键词：油菜；乙酰乳酸合酶；叶绿体信号肽；亚细胞定位；融合蛋白；原核表达；酶活 中图分类号：Ｓ５６５．４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００７－９０８４（２０１８）０３－０３０９－０９ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｎｇ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＢｎＡＬＳ３ｇｅｎｅｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ ＨＵＭａｏ－ｌｏｎｇ，ＬＯＮＧＷｅｉ－ｈｕａ，ＧＡＯＪｉａｎ－ｑｉｎ，ＣＨＥＮＦｅｎｇ，ＺＨＯＵＸｉａｏ－ｙｉｎｇ，  ＺＨＡＮＧＷｅｉ，ＣＨＥＮＳｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅ－ｆｕ，ＰＵＨｕｉ－ｍｉｎｇ （ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｒｏｐｓ，ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｏｔｔｏｎａｎｄＲａｐｅｓｅｅｄ（Ｎａｎｊｉｎｇ）， ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／ＮａｎｊｉｎｇＳｕｂ－ｃｅｎｔｅｒ，ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＯｉｌＣｒｏｐｓＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ＢｎＡＬＳ３（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎ ｔｈａｓｅ）ｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａ