细胞生物学 第三章细胞生物学研究方法精品课程.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;第二节 细胞组分的分析方法;第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、光学显微镜技术（light microscopy);三、 扫描遂道显微镜;普通复式光学显微镜技术;荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）;激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）;?相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 ?微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器 ?录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动 ;电镜与光镜的比较;电镜与光镜光路图比较;电子显微镜的基本构造;主要电镜制样技术;扫描电镜;一、 离心分离技术;二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法;三、特异蛋白抗原的定位与定性;四、细胞内特异核酸的定位与定性;五、放射自显影技术;六．定量细胞化学分析技术;一、细胞的培养; 二、细胞工程 ;对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈;;;;;;;A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC;;;Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassiumphosphotungstate 钾磷钨酸(a) or shadow casting with chromium铬(b).;;;;;由Binnig等1981年发明。 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。 电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化???可显示出原子水平的凹凸形态。;在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。（速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀） ;用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 ;福尔根反应 自Feulgen等1924年发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。 具体反应原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。 简言之： DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 ;;;免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。 由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。