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免疫金标记技术在体外诊断领域的应用 来源：丁香园 关键词：免疫金 标记技术 体外诊断领域 应川 牛产企业必须能够克服大量的技术难题才能制备出能应川丁-诊断领域的免疫金复合物。 免疫金标记技术是一?种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复 合物的技术。虽然这种免疫金标记技术呈现出多种多样的应用方式，但目前主要应用是以 快速检测试纸盒的形式使用于疾病的诊断和临测。1 IVD检测系统中，蛋白与胶 体金（上图）联接制备成的免疫金结合物是指示试剂。 在过去的I?年?里，基于膜上的快速诊断技术（包括侧向层析和渗滤两种形式）的发展为金标 免疫试剂创造了冃人的市场。使川该技术制备的标记物作为检测系统中的指示试剂使川在 检测敏感症、传染病、环境污染物、毒品、心梗标志物、早孕以及曽医等领域。2 如同其他标记结合物一样，获得成功的结果必须通过采用优质的试剂（蛋白质和胶体金）、 丰富的生产经验和对标记物产品最终结杲分析的完整的知识结构，这需要与免疫金产品使川 方法的终端客户培训一起进行。 蛋口质的标记 在体外诊断应用领域，通常采用抗原或抗体与免疫金结合制备免疫金结合物。采用单克降 抗体或多克隆抗体，是影响抗体标记的因素2—。 虽然诊断产品中大多数抗体标记采用IgG抗体，但IgM、IgE和IgA抗体也可以成功标 记上胶体金。标记时，进一步必须考虑抗体的亚型。在鼠抗IgG亚型中，例如IgGl亚型 成功率高，而IgG3亚型被证实有技术难度。 将抗原标记胶体金也而临技术难题。将常见的抗原标记上胶体金比较容易。但是受抗原与 胶体金结合方式的影响，金标记覆盖的蛋白反应决定簇小于50%时才能高成功率制备出标 记物。因此，考虑蛋白结合金的方式对标记开发人员非常重要。3 联接机理 研究人员普遍接受的理论为，三种特异的氨基酸残基在金颗粒与蛋口质的联接作用中发挥 着重要的作用。而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸与胶体金联接的作用机理各不相 同。4 ?赖氨酸带有较强的正电荷，因而自然吸附带负电荷的金颗粒； ?色氨酸主要通过疏水和互作用与胶体金和联接； ?半胱氨酸通过SH-与金表面以共川电了的形式形成配位键。抗体通过这儿种作川力与胶体 金颗粒牢固、稳定的、不易分离的结合在一起。在很大程度上，标记成功与否取决于上述三 种氨基酸残基在被标记蛋口质上的结合位点。 在某种情况下，氨基酸联接于蛋白质的活性部位，从而干扰蛋白质的反应活性。空间位阻的 限制，当这几种氨基酸残基定位于抗体的抗原结合部位或抗原的特异抗体结合决定簇部位 吋，可能出现这种类型的干扰。如杲被标记的蛋白质分子未做特定的处理就儿乎不可能克服 这种干扰。 为了在免疫检测中获得报佳的灵敏，这三种与标记相关氨基酸的止确结合是非常重要的。就 标记抗体来说，这三种氨基酸应定位于Fc区，血对于标记抗原，它们应远离抗原的反应决 定簇位置。 Absorbing pad Capture line Test line 标记方法的调试 为了开发、优化单一标记的胶体金结合物，研究人员通常制备小批量的多达6（）批次的不同 胶体金结合物。每批次胶体金结合物在某一关键制备步骤上都与其它不同，各批次都被测试 从而确定哪种标记技术对丁 ?最终的检测分析可能获得最佳的反应结果。 这类调试应该包括所有可以改善胶体金结合物的灵敏度、交叉反应以及潜在稳定性的技术 参数。典型的测试应包含但不应仅限于抗体工作缓冲液、防腐剂的类型、盐度、表面活性剂 含量、胶体金颗粒的尺寸、封闭剂的类型、总蛋白浓度、结合物工作缓冲液以及结合物的浓 度。为了确定不同封闭剂的效果，建议考虑以下调试内容： ?封闭剂的类型（如酪蛋白、BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、PEG、非特异性IgG） ?封闭剂的纯度 ?封闭剂的含量 ?封闭剂对整个测试反应的兼容性 研发人员应该根据在原型产品上的量的调节试验结果确定上述所有试验指标最佳值。最后, 无论如何，唯一的检测方式是将结合物应用于尽可能模仿最终测试条件制做出來的小型测 试条前期产品中。对于基于膜某础上的检测分析来说，最简易的方法是使用半试纸条形式 来做检测，仅需要使用捕获抗体和纯抗原（见图1）。在使用这种简单的测试形式下，很多 小批量结合物就能被评估得到比较合适的测定结果，而可以避开一些普遍的问题例如：与干 燥相关的技术问题或者样品缓冲液的问题。 图1图示为用于测试标记物的半试纸 为了满足上述试验的要求，常需要3mg抗体或者5mg抗原。采用小样样木，能够获得最 优化的胶体金结合物制备参数，并能提供初步的评估样本。一口使用优质的抗体或者抗原用 于标记，且确定了制备参数，牛产商就能容易地制备重复性好和批量化的供选用的结合物。 川于胶体金标记原料的品质 应川在制备免疫金结合物的特异性抗体的稳定性主要取决于检测试验的技术条件。对于侧