固态发酵产酶及DL-色氨酸的拆分-生物化工专业论文.docxVIP

南京工业大学硕士学位论丈固态发酵产酶及DL一色氨酸的拆分 南京工业大学硕士学位论丈 固态发酵产酶及DL一色氨酸的拆分 摘要 色氨酸主要用于医药行业，如氨基酸输液、抗闷剂和抗臭滤药等，与铁复 合剂、维生素合用可提高抗贫血疗效，还可用作消化溃疡组氨酸的佐药。同时， 色氨酸是继蛋氨酸，赖氨酸之后第三大饲料添加剂，由于其对动物生长的独特作 用，将有可能成为饲料添加剂行业的后起之秀。但目前过高的售价(60万／吨以 上)限制了其大规模应用，若能降低其制各成本，其年需求量将会有大幅度的增 长。近年来，开发色氨酸的规模化、低成本制备方法。一直是氨基酸制造行业的 热点。 本论文对米皓氮基酰化酶的拆分制备L一色氨酸进行了优化研究：包括固态 发酵产米曲酶的优化研究，米曲氨基酰化酶的分离纯化及其酶学性质研究，以及 氨基酰化酶的固定化研究。 对于固态发酵制备氨基酰化酶，对制曲条件和固态发酵培养基的组成进行了 研究：最佳发酵培养基组成基质原料比为8：2，水活度为O．7，最佳产酶时间为 48h。添加诱导物基本上没有作用。复合促迸剂中吐温罐O和植酸同时存在时米曲 霉3042的激活作用大幅度提高。添加复合促进剂后，固态发酵米曲霉产氨基酰 化酶的酶活达到最高值的时间为35-40h，可以比不加促进剂的时间缩短了5-10h： 且拆分N一乙酰一DL一色氨酸的酶活也提高171．94％。 对米曲氨基酰化酶的纯化研究，尝试了硫酸铵盐析分级沉淀、疏水层析、凝 胶电泳等一系列粗分级和细分级的纯化方法，并对米曲氨基酰化酶的酶学性质进 行了探讨。用硫酸铵分级沉淀，40％饱和度去除大部分杂蛋白，60％饱和度时沉淀 下来的大部分是所需要的酶，盐析纯化倍数可达6倍。粗酶液经疏水层析柱后， 纯化倍数可达28倍。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定氨基酰化酶亚 基分子量，凝胶电泳有2条带，第一条带的分子量)966，200Da第二条带的分子 量为31，000Da。 南京工业走学硕士学位论文氨基酰化酶的最适pH值为7．2，最适底物浓度0．25moi-L～，最适反应温 南京工业走学硕士学位论文 氨基酰化酶的最适pH值为7．2，最适底物浓度0．25moi-L～，最适反应温 度为55。C，在高底物浓度时存在底物抑制，Co”能提高酶活力，Fe”对酶有轻微 抑制作用，产物L一色氨酸和醋酸根对酶有较强的抑制。盐浓度对拆分过程是有 抑制作用。抑制剂对保存稳定性的研究可见，DTT加入量为3mmol／L时，使酶保 存稳定性有所提高。对粗酶制剂进行了尝试，自制冻干粉保存稳定性良好，可保 存半年不失活。 研究了氨基酰化酶的多种包埋方法，尝试了合成树脂共价交联法固定化米瞌 氨基酰化酶。用不覆膜，单次覆膜和两次覆膜的固定化酶进行批次拆分实验比较， 两次覆膜改性海藻酸钙凝胶包埋固定化氨基酰化酶效果最好，能反应20个批次。 合成树脂柔性链共价交联固定化酶的实验，柔性链越长固定化效果越好。戊二醛 用量O．8％对于0．29粗酶冻干粉和0．29树脂固定化来说效果最好。 关键词： 米曲氨基酰化酶固态发酵纯化酶学性质固定化L一色氨酸 II SSF SSF for Aminoacylase and resolution of DL-Tryptophan Abstract Tryptophan is major used in the field of medicine，such aS transfusion of amino acid，the medicine of curing anemia，the a由uvant of histidine．At the same time， tryptophan is the third feed additive in the field of feedingstuff besides methionine and lyskle，may be the atx up—and-coming talent in the field for its unique action on the growth of animal．at the present time，the overprice(Y600，000／ton)has limited its application with large scale．If we can cut down the cost，its market demand will increase rapidly．In resent years，it is generally believed that L-tryptophan was prepared through chemical synthesis and enzymatic resolution with