霍乱弧菌与自由生活阿米巴原虫共生的研究-流行病与卫生统计学专业论文.docxVIP

复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 中文摘要 霍乱弧茵与自由生活阿米巴原虫共生的研究 摘 要 自1817年以来，霍乱弧茵已引起7次霍乱世界大流行，迄今尚未得到有效 控制，仍然是全球性的重要卫生问题之一。虽然近年来对于霍乱弧菌的生物学特 性的认识取得了长足进展，但关于该菌在霍乱疫区季节性流行、流行间歇期的生 存问题以及越冬机制依旧困扰着微生物学者。自由生活阿米巴原虫(bee．1iving amoebae，FLA)广泛分布于自然界中，它作为一些重要的致病菌如军团菌、分 枝杆菌和副衣原体等的储存宿主和传播媒介越来越受到人们的重视。FLA原虫， 尤其是其包囊，能抵抗不利的温度、pH、杀虫剂、化学药品以及消毒剂的作用， 同时也对其胞内菌在抵抗不利的物理和生化环境时起到重要的保护作用。FLA 原虫是霍乱弧菌复杂的水生态环境中的重要成员。为此，本课题通过共培养实验 观察FLA原虫与霍乱弧菌之间的相互关系，探讨FLA原虫在不同温度以及消毒 剂作用下对霍乱弧菌存活的影响，可为阐明自由生活阿米巴原虫对霍乱弧菌在外 环境中生存的影响以及霍乱的防治提供新的思路、策略和理论依据。 28℃实验环境下以埃尔托型霍乱弧菌、古典型霍乱弧菌以及非01群霍乱弧 菌分别感染多噬棘阿米巴原虫。Gimenez染色结果显示，共培养8hr后霍乱弧 菌进入棘阿米巴原虫滋养体体内。共培养24hr，霍乱弧菌在棘阿米巴滋养体体内 增多。电镜下，霍乱弧菌主要存在于棘阿米巴滋养体吞噬体空泡内，随着滋养体 包囊化，霍乱弧菌主要分布于包囊胞浆吞噬空泡内、双层细胞壁之间以及胞膜周 围。此外，还可在棘阿米巴内侧细胞壁与胞膜之间观察到古典型霍乱弧茵。在棘 阿米巴滋养体吞噬空泡内可观察到处于二分裂形态的霍乱弧菌，提示霍乱弧菌能 在棘阿米巴滋养体内进行分裂繁殖。包囊传代实验表明，霍乱弧菌能在包囊在分 化成滋养体的过程中释放出胞外。因此，阿米巴原虫滋养体可成为霍乱弧菌增殖 的孵化器，而阿米巴原虫包囊为霍乱弧菌环境生存提供了条件。 在4C水环境中，与棘阿米巴原虫共培养的埃尔托霍乱弧菌的活菌数在30d 内由感染前的(3．32如．43)x 109cfu／ml降低为1 efu／ml，而对照组到45d时才下降到 l efu／ml。但与埃尔托霍乱弧菌共培养50d的棘阿米巴包囊可经包囊传代再检测 出埃尔托霍乱弧菌。在28C条件下，棘阿米巴的存在可使埃尔托霍乱弧菌在水 环境中维持较高的浓度。隔离试验结果表明，棘阿米巴原虫分泌或代谢所产生的 复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 英文摘要 物质可能有利于霍乱弧菌的生存。棘阿米巴包囊提高了埃尔托霍乱弧菌在低温水 环境中的生存能力，但模拟环境下尚不足以保护其在低温下长期生存。 为确定环境中霍乱弧菌与FLA原虫两者之间的关系，我们在黄浦江水域中 分离得到一株非01群(非0139群)霍乱弧菌，并在同一水域的河水和河岸土 壤中各分离到的1株自由生活阿米巴原虫。以自由生活阿米巴18S rRNA通用引 物PCR检测阳性，特异性引物检测结果显示均为棘阿米巴属。将序列在Clone Manager软件中与参照序列进行多重比对，分离自黄浦江水域的棘阿米巴 W-HPR和E．HPR的基因型均为T4型。将分离自同一水域的非01群霍乱弧菌 分离株与W．HPR棘阿米巴在28℃共培养8h后，非01群霍乱弧菌进入棘阿米 巴原虫滋养体体内。随着共培养时间的延长，霍乱弧菌在W．HPR滋养体体内逐 渐增多。因此，本实验结果间接反映出黄浦江水域中非Ol群霍乱弧菌分离株与 棘阿米巴原虫之间可存在共生关系。 为探讨消毒剂对棘阿米巴原虫及其胞内霍乱弧菌的杀灭作用，采用不同浓度 有效氯含量的漂粉精进行消毒试验。漂粉精消毒模拟水样作用30min能杀灭棘阿 米巴滋养体和包囊的最低有效剂量分别为50mg／L和125mg／L。8份上海居民饮用 水中的4份水样经NNA平板培养可观察到FLA原虫。含有效氯浓度为2mg／L 的漂粉精消毒剂在杀灭埃尔托霍乱弧菌时，棘阿米巴原虫能对埃尔托霍乱弧菌在 抵抗消毒剂作用时起到一定的保护作用。 综上可见，霍乱弧菌在适应棘阿米巴原虫环境后，能利用原虫所提供的养料 进行分裂、增殖、生长，两者属于共生关系。在常温下，棘阿米巴的存在可使埃 尔托霍乱弧菌在水环境中维持较高的浓度；而在低温水环境中，虽然棘阿米巴包 囊能提高埃乱弧菌的生存能力，但模拟环境下尚不足以保护其在低温下长期生 存。同时，棘阿米巴原虫能对埃