可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ--脂联素球部融合蛋白改构体的真核表达和制备分析-免疫学专业毕业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文中文摘要 温州医学院硕士学位论文 中文摘要 可溶性肿瘤坏死因子受体II．脂联素球部 融合蛋白改构体的真核表达和制备分析 目的 通过对中国专利(专利号ZL200510100468．9)中描述的融合蛋白人肿瘤坏 死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因(sn师RJI．掣如)进行基因改造， 构建形成更加稳定的融合蛋白sTNFRII．gAD．new，构建真核细胞表达载体，并 实现此融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达，筛选工程细胞株，大规模培养细胞， 探索大规模纯化上清的方法，鉴定其生物学活性，为动物体内实验打下基础。 方法 首先通过PCR和重叠PCR的方法，将sTNFRII．gAD融合基因中sTNFRII 与gAD间的酶切位点和胶原序列去除，得到改构后的基因序列sTNFRII．gAD —new和sTNFRII．gAD．His．new，再克隆入质粒 pAAV2neo．CMV-MCS．PGK-DHFR中，得到真核表达载体pAAV2．sTNFRII． gAD—new和pAAV2一sTNFRII—gAD-His—new。合成改构融合蛋白 sTNFRII—gAD．new在CHO细胞中表达的偏爱密码子，再克隆入质粒 pAAV2neo．CMV-MCS．PGK-DHFR中，得到载体pAAV2．opti．sTNFRII．gAD。 然后将构建好的质粒转染哺乳动物细胞BHK．21S，CHO／DG44和CHO／dhfi一-， 用有限稀释兼软琼脂法挑取单克隆，点杂交比较蛋白表达后，选取表达产量高的 单克隆细胞株作为生产细胞株。利用转瓶工艺，扩大培养筛选出的生产细胞株， 再换成无血清培养基收获上清。收获的细胞上清通过初步离心分离，pellicon切 向流超滤系统浓缩，阴离子交换色谱和分子筛分离的纯化工艺，制备 sTNFRII—gAD．IleW融合蛋白。分析型超速离心分析经分子筛分离出的融合蛋白 的分子量。经典的体外L929细胞活性检测法检测融合蛋白sTNFRII．gAD．new拮 抗TNF．a的能力。为了比较改构与未改构蛋白之间的稳定性差异，将纯化后的蛋 白分别置于4℃，37℃，42℃36h，之后做western blot检测有无降解的条带和蛋 白的存在形式。探索合适蛋白保存的溶液配方。 结果 分子克隆得到含有改构后融合蛋白sTNFRII．gAD．new的质粒pAAV2． sTNFRII·gAD—new和pAAV2-sTNFRII-gAD—His．new，酶切和基因测序均正 确。 构建了具有CHO偏爱表达的基因载体pAAV2．opti．sTNFRII．gAD。 2 温州医学院硕士学位论文质粒pAAV2一sTNFRII-gAD-new，pAAV2．sTNFRII．gAD．His．new和 温州医学院硕士学位论文 质粒pAAV2一sTNFRII-gAD-new，pAAV2．sTNFRII．gAD．His．new和 pAAV2·opti—sTNFRII—gAD瞬时转染BHK-21S细胞，用sTNFRII抗体检测上清 中有目的蛋白表达。 质粒pAAV2·sTNFRII—gAD-IleW和pAAV2-sTNFRII—gAD．His．new稳定 转染BHK．21S细胞，经过G418加压后得到多克隆细胞株BHK．21S／pAAV2一 sTNFRII·gAD-new和BHK-2 1 S／pAAV2一sTNFRII—gAD-His．new。 BHK一21S／pAAV2-sTNFRII—gAD．IleW多克隆细胞株挑选单克隆，得到表达量较 高的单克隆细胞株，命名为e717。 质粒pAAV2一sTNFRII-gAD．IlCW稳定转染CHO DG44细胞，得到稳定表 达的多克隆细胞株。 质粒pAAV2·opti—sTNFRII-gAD稳定转染CHO／dhfr细胞，经过G418加压 得到多克隆细胞株，有限稀释法挑选单克隆细胞株，并且通过MTX不断加压， 挑选得到高表达工程细胞株cⅢ40。 转瓶扩大培养细胞，收集上清无血清培养基，经过离心，pellicon切向流超 滤系统浓缩，阴离子交换色谱和分子筛分离组成的下游纯化步骤，可以制备纯度 均一的sTNFRII．gAD．new融合蛋白。 分析型超速离心结果显示分子筛蛋白峰中所含蛋白的分子量为159KD，为 sTNFRII．gAD．new蛋白单体52KD的三倍，证明了三聚体蛋白的存在。 融合蛋白sTNFRII．gAD．new的稳定性实验显示在不同的温度下，改构后 的蛋白没有降解的条带。蛋白主要以三聚体和单体的形式存在。 体外活性测验sTNFRII．gAD．new融合蛋白具有显著抑制TNFa杀伤L929细 胞活性的作用。 蛋白保存的配方实验证明增加溶液中盐离子的浓度可以增加蛋白的聚合。 结论 本实验完成