课件：焦磷酸测序.ppt

焦磷酸测序 峰形图 峰高与结合模板的dNTP数量成正比 原始数据会被软件自动转化为序列信息 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 基因测序 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。 A-T-T-C-A-C-G-G-T-A-C 焦磷酸测序步骤 一 PCR 二 焦磷酸测序 PCR 聚合酶链式反应 亦称之为DNA扩增，是DNA复制的体外模拟 普通PCR 实时荧光定量PCR PCR反应的基本步骤 高温变性 低温退火 适温延伸 具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点 一、PCR反应的条件 1、一定的缓冲溶液； 2、DNA模板； 3、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4、四种脱氧核苷酸：4种dNTP混合物； 5、耐热的DNA聚合酶； 6、控制温度（PCR重要条件）。 二、DNA变性和复性 在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 三、复制方向（5’~3’） 1、DNA分子的3’端与5’端：-OH端为3’; 磷酸基团的末端为5’ 。 2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。 1、DNA聚合酶催化 2、DNA的延伸方向:5’->3’ 四、引物问题 1、两种引物：DNA或RNA，长度15-30bp， 常用为20bp左右。 2、原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 五、PCR过程 变性 ——复性——延伸 1、变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解为单链。 2、复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 3、延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 4、 循环特点： ① 上一次循环的产物为下一循环的模板 ② 结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代DNA分子中 ） ，其它子代DNA分子都为双引物分子 ③ 处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N 可编辑 可编辑