免疫细胞的分离技术.ppt

免疫细胞的分离 免疫细胞 1、概念 直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。 2、分类 ＊单核吞噬细胞系统：单核细胞 / 巨噬细胞 树突状细胞（DCs) ＊淋巴细胞系统：T 淋巴细胞 （Th / Tc) B 淋巴细胞 NK 细胞 ＊粒细胞系统: 中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞 免疫细胞的分离 人外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞的分离 免疫细胞亚群的分离 细胞分离原理 细胞的大小和比重 细胞表面标志 细胞黏附于各种物质表面的特性 一、人外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll分层离心法 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。 原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。 不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092 单个核细胞 1.070 分层液 1.077 一、人外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll分层离心法Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。 二、淋巴细胞的分离 尼龙棉柱法 E花环分离法 补体细胞毒法免疫荧光法 二、淋巴细胞的分离 ——尼龙棉柱法 原理：B细胞和单核细胞具有易黏附的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37 ℃作用1~2h后，洗脱的为非黏附性的T细胞。 二、淋巴细胞的分离 — E花环分离法（纯化T细胞） 三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法 流式细胞术 三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法 原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连， 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。 三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法 1. 直接法： 抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细胞 2. 间接法： 第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞 免疫磁珠法分选装置 三、免疫细胞亚群的分离 —流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。 原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。 流式细胞仪工作原理 流式细胞仪 免疫细胞的分离 人外周血单个核细胞的分离——Ficoll分层离 心法 淋巴细胞的分离——尼龙棉柱法、E花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法 免疫细胞亚群的分离——免疫磁珠分离法、流式细胞术 谢谢！ * * * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 PBMC 尼龙纤维棉柱 B细胞 单核细胞 T细胞 原理 ＊成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，CD2分子），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。 ＊ E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。 ＊ E花环周围的绵羊RBC可 用低渗法除去。 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫细胞的分离 * * 免疫