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细胞与亚细胞结构的分离Separation of Cells Organelles 生物学及医学研究一般涉及： 整体、器官、组织、细胞、细胞器及分子水平。 其中，细胞、细胞器及分子水平的研究，均需分离细胞或细胞器。 一、从动物组织游离细胞 一)步骤 二)方法 1、非酶法 2、酶法 二、细胞器的游离 三、细胞与细胞器的分离 一)沉降法纯化细胞或细胞器 1、差速离心 2、密度梯度沉降 1)速度沉降 2)等密度沉降平衡 二)电泳法分离细胞 三)亲和吸附法分离细胞 四)根据细胞的生物学特性分离细胞 五)流式细胞术分离细胞 一、从动物组织游离细胞 细胞的微环境 cell-------------------cell----------extracellular matrix(ECM) 细胞连接(如连接蛋白) 细胞粘附(ECM-R介导) 细胞粘合(CAM介导) 媒介：二价阳离子(尤其是Ca2+，如桥粒的中央层)；大分子(如糖蛋白和蛋白聚糖) 不同组织具有不同的细胞间质成分，不同组织中，参与细胞粘合与细胞连接的大分子成分也各不相同，所以，在游离细胞时，不同组织的细胞对不同试剂和不同方法具有不同的敏感性。------游离技术复杂，游离方法多样。 有时，同一种组织可用不同的方法游离出单个细胞，但所获得的细胞在表面性质、激素反应状态及物质和能量代谢上可能各有不同。------应根据实验目的选择游离方法。 游离方法成功-----细胞活率与产量均高，并尽可能地保留细胞结构与功能的完整性。 注意游离条件： 1、游离剂的种类 2、游离剂的浓度与作用时间 3、缓冲液的成分 4、pH 5、溶液的渗透压与盐成分 6、酶终止剂 对不同动物、不同组织或不同年龄的组织，有时游离方法不能通用。 一)步骤 1、用利剪剪碎组织或切成0.3~0.4mm的薄片，必要时匀浆。------组织块应尽量细小，保证细胞的供氧。 2、用游离剂处理，破坏细胞之间及细胞与ECM之间的联系------在组织与游离剂保温前，保持低温以降低氧的消耗；选用适当直径的容器，以便液面的高度适宜，利于组织块的氧供给。 二)游离细胞的方法 1、非酶法------较温和 1)螯合剂(chelating agent)----常用于游离 上皮组织细胞 常用：EDTA---结合Ca2+，Mg2+ EGTA---结合Ca2+的能力与EDTA 相似，但在中性或碱性条件 下结合Mg2+的能力大大小于 EDTA。 去除Ca2+，Mg2+-----EDTA 去Ca2+留Mg2+-----EGTA 常与酶联合使用，如细胞系传代常使用0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶(1:1或2:1)。 EDTA对某些细胞有损害，如可损伤线粒体等。-----尽量缩短细胞在无Ca2+或有EDTA环境中的时间。 2)甘氨酸(glycine)-----可与EDTA联合应用。 3)糖类(saccharide)----细胞表面的凝集素可识别并结合细胞粘合分子和细胞连接分子的糖链结构，这种作用能被相应的单糖、双糖或寡糖所抑制。（参见下页） 4)升高pH----改变细胞表面电荷 如，胚胎组织，0.5%KOH溶液调至pH9.8，3~5分钟 5)机械力游离-----玻璃匀浆器，注射器(6#针头)。注意轻缓，减少膜撕裂。（许多癌组织中癌细胞间细胞连接减少、减弱，容易脱落形成转移灶，可直接用机械力游离。） 2、酶法----蛋白水解酶，辅助酶 几种酶或酶与非酶试剂联合使用，效果较好。 1)蛋白水解酶(proteolytic enzyme) 粗胰酶(pancreatin)----混合酶，含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、RNA酶、脂酶、淀粉酶及磷酸酶。 不同批号和来源的产品，其组成成分及各成分的活性变化很大----应根据需要选择不同来源的产品。 防止支原体污染---酸性条件下处理胰酶 10%胰酶，pH1，4~10℃数分钟(杀死各种微生物) 过夜(杀死细菌的孢子) 调回pH7，-20℃分装冻存备用。 常用浓度 0.01%~0.5% 温度及时间 37℃ 1～2分钟至1～2小时 R.T. 时间稍长 4℃ 几小时甚至过夜 0℃ 慢作用，时间长 常用于游离单层培养细胞，作用时间尽可能短，以减少对细胞的损伤。 牛血清中含有其抑制剂，可终止反应。 结晶胰蛋白酶(trypsin)-----作用强烈，适于消化分散较软组织。 由于其作用的特异性，限制了其水解能力。 Ca2+、Mn2+并非其活性所必需，但可稳定此酶。 可牢固附着在细胞表面，需加牛血清抑制其反应。 胶原