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脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松及其成骨分化蛋白质谱构建 南方医科大学级博士学位论文 脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松及其成骨分化蛋白质谱构建 ? 课题来源:国家重点基础研究规划项目 编号: 国家自然科学基金青年面上项目编号: 广东省工业攻关项目编号: 专 业 名 称 人体解剖与组织胚胎学 学位申请人 闻重秋 指 导 教 师 原 林教授 答辩委员会主席 汪华侨教授 苏光燮教授 答辩委员会成员 朴英杰教授 徐杰教授 何宏文教授 郭国庆教授 黄 泳教授 论文评阅人 贺振泉教授 安 靓教授 初国良副教授 日 年月 广州博士学位论文 脂肪源干细胞治疗骨质疏松及其成骨分化 差异蛋白质筛选 博士研究生:闻重秋 指导老师:原林教授 摘 要 背景 骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易 于骨折的代谢性疾病。随着人口老龄化,骨质疏松患者不断增多,研究如何有 效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假 说认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储 备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组 成。功能系统是在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以 筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化 为各种定向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细 胞源泉,并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳 定。因此,功能系统只有在支持与储备系统的支持下,才能维持结构和功能的 稳定,而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新的补充,机体就会出 现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞 未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此,当骨代谢过程中 出现负平衡后,如何有效增加筋膜支架中未分化的干细胞,使成骨细胞得到有 效的补充,促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。 脂肪组织是支持与储备系统中重要储备,其中分离出的脂肪源干细胞摘要 ,是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要细 . 胞储备形式。脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明: 脂肪源干细胞易分离培养;具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在特定 的环境中可以诱导向成骨、成肝细胞、成心肌细胞、成软骨、成脂、成肌和成 神经等分化;具有低免疫原性和免疫调节功能。此外,与目前研究较多的骨髓 干细胞相比,脂肪源干细胞来源更广,获得更加容易,并且给病人带来的创伤 和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此, 通过增加机体未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会 对骨质疏松起到预防和治疗作用。 应用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂 量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,骨保护素分泌减少,甲状 旁腺素的分泌增加,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加 等多种途径使骨吸收增加,骨形成减少,最终导致骨质疏松。 蛋白质组指“一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质,是对应于一个 基因组的所有蛋白质构成的整体,而不仅局限于一个或几个蛋白质。蛋白质组 学可以从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰 状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规 律。由于蛋白质的分子量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质,而双向 电泳技术则同时利用这两个性质的差异来分离细胞中的总蛋白质,因此它的分 离能力强大,可以快速准确的发现表达发生变化的蛋白质。 为探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,及脂肪源干 细胞成骨诱导中的蛋白质谱变化,本实验通过观察移植异体脂肪源干细胞对糖 皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学方面的影响及蛋白质谱变化分析进 行综合评价,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗 提供新的研究思路。 目的 、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定,以判 Ⅱ博士学位论文 断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞; 、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功: 、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质 .. 疏松大鼠骨组织微环境的影响; 、对成骨周及周的脂肪源干细胞进行蛋白质谱分析。 、为“筋膜学假说中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治 疗退行性和衰老性疾病提供部分实验依据。 方法 、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫,胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂 肪源干细胞。传至第代时,分别通过形态学、成脂与成骨诱导分化及利用流 式细胞术对表面抗原、、、、和进行鉴定,