重组大肠杆菌高密度发酵研究进展.docVIP

生物制药课程综述 题 目 重组大肠杆菌高密度发酵研究进展 学 院 农学院 专 业 生物技术 班级 091 姓 名 吐尔迪.吐尼亚孜 学号 093135140 指导教师 葛杰 2013 年04 月24 日 新疆农业大学教务处制 重组大肠杆菌高密度发酵研究进展 摘要：　重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代谢副产物——乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸积累的技术方法。 关键词：重组大肠杆菌；高密度发酵；补料分批培养；比生产率；乙酸； 重组DNA 技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白特别是基因工程药物能够大量生产,应用于临床的基因工程药物的市场正以每年5 - 15 %的速度增长[ 6 ],预测到2003 年世界药品市场的总销售额约为2500 亿美元,基因工程重组蛋白类药品的总销售额至少可占10 %[ 1 ] 。 大肠杆菌在重组蛋白质生产的过程中占主导地位。采用高密度培养技术,也就是高密度发酵技术,提高菌体的发酵密度,最终提高产物的比生产率不仅可减少培养体积、强化下游分离提取,还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本,能极大地提高在市场上的竞争力。 这一目的的实现,除了重组菌本身的表达性质外,还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件,包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。我们实验室采用该技术,大大推动了重组人肿瘤坏死因子,白细胞介素-3 ,骨形成蛋白2-A,降钙素的下游研究。 1 .　影响高密度发酵的几个表观因素 1.1 高密度发酵培养基 培养基的组成成分可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基。其组成元素包括C、H、O、N、S、P、Fe 、Mg、K 等,根据在基本培养基中的菌体生长量可以推导出每种元素获得1g/ L 的大肠杆菌菌体所需的无机盐(L-1 ) : 0.77g NH4Cl , 0.125gKH2PO4 , 17.5mg MgSO4·7H2O , 7.5mg K2SO4 , 0.64mg FeSO4·7H2O , 0.4mg CaCl2。 大肠杆菌高密度发酵使用的培养基一般为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例,如果碳氮比偏小,会导致菌体生长旺盛,造成菌体提前衰老自溶;碳氮比过大,菌体繁殖数量少,细菌代谢不平衡不利于产物的积累;碳氮比较合适,但碳源、氮源浓度高,虽然发酵起始导致菌体的大量繁殖,但发酵后期菌体生长缓慢,代谢废物过多,增大发酵黏度,影响溶解氧浓度,容易引起菌体的代谢异常,影响产物合成;碳氮比较合适,但浓度过低,会影响菌体的繁殖。这就能解释为什么单纯靠增加营养物质并不能实现高密度。一般而言, 大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为:葡萄糖(50g/L) 、氨( 3g/ L ) 、Fe2 + ( 1.15g/ L ) 、Mg2 + ( 8.7g/ L ) 、PO43 - (10g/ L) 、Zn2 + 如果培养基仅仅适合宿主菌的生长对工程菌高密度发酵而言远远不够,利用合成培养基可以很容易使菌体达到高密度,但往往会发生外源基因不表达的现象。Allen 和Luli曾用合成培养基培养重组大肠杆菌, 菌体在很短时间( 13h) 达到了79g / L ,但外源基因没有表达。J ung等改变生长阶段的C/ N 比例,对INF-β表达影响不大,而改变诱导后补料中C/ N 比,则会显著影响外源基因的表达效率。Tsai等还发现,在IL-2发酵时,在合成培养基中加入亮氨酸会使甲硫氨酸被亮氨酸错误取代的几率从19 %降至2 %。 1.2 　表达基因的调控 重组菌的表达调控方式对发酵过程有重要的影响,高密度发酵也必须据此而采取相应的控制,遵循外源基因的表达规律和诱导后细菌的生长规律才有可能达到高密度、高表达发酵。适合作为大肠杆菌外源基因表达的启动子有λ噬菌体启动子PL、PR 、tac、t rp 、Ipp 、lac 启动子,还有一种表达方式,就是组成型表达,无任何