极端嗜盐古菌嗜盐菌素C8的分离纯化和基因克隆-海洋生物学专业论文.docxVIP

中国海洋大学博士学位论文摘要 中国海洋大学博士学位论文 摘要 嗜盐菌素(Halocin)是由极端嗜盐古菌(Extremely halophilic archae曲分泌到 胞外的对其相近属或种的微生物有抑制或致死作用的蛋白类抗生素，它是极端 嗜盐古菌(尤其是杆菌)的一个普遍特征，是研究极端嗜盐古菌基因表达调控和 蛋白分泌、结构和功能的理想材料。 为了进一步在蛋白和基因表达水平上对嗜盐菌素的多样性进行研究，我们 对22株极端嗜盐古菌进行了产嗜盐菌素的筛选。抑菌实验发现，在22株极端 嗜盐古菌中，有21株可以产生嗜盐菌素：只有1株(Halobacterium sp．QD3) 不产嗜盐菌素。其中，有6个嗜盐菌素(Hal C6、Hal C8、Hal C9、Hal C16、 Hal C17、Hal C22)抑菌谱比较广，可以抑制大多数(≥10)极端嗜盐古菌的生 长。对这6个嗜盐菌素分别进行理化性质的测定，发现Hal C8性质非常稳定，是 研究嗜盐菌素的理想材料。 Hal C8是由Halobacterium sp．AS7092产生的。采用切向流过滤及柱层析 等技术分离纯化了嗜盐菌素C8。纯化后的嗜盐菌素C8在Tricine SDS—PAGE上 表现为单一条带，分子量大小为6-3 kDa，等电聚焦测得其等电点为4．4左右。采 用Edman降解法对其N端蛋白序列进行测定，其N端15个氨基酸的序列是 D．I—D．I—T-G—C．S—A—C—K—Y-A—A—G。Hal C8性质非常稳定，可于100℃煮沸1小 时而不失活；对去盐作用不敏感：对蛋白酶K敏感，但对胰蛋白酶不敏感：对 大多数有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈等不敏感。Hal C8对大多数的极端嗜盐古 菌(包括部分嗜盐碱古菌)有抑制作用，但对细菌则无明显的抑制作用。将敏 感菌株Halorubrum saccharovorum ATCC29252的细胞用嗜盐菌素C8处理后， 采用电镜观察，发现处理2小时后细胞开始肿胀、膨大，接着在细胞的两端出 现裂口，细胞内容物开始向外溢出，随着时间延长，裂口越来越大，发生这种 变形的细胞也越来越多，最后，几乎所有的细胞完全裂解。因此，嗜盐菌素C8 历云： 历云： 极端嗜盐古菌嗜盐菌素c8的分离纯化和基因克隆 的作用方式是杀菌作用，作用位点可能位于细胞壁上。 根据嗜盐菌素C8的N端氨基酸序列设计了一对简并引物(C8—2，C8—4)， 利用这对引物从AS7092的总DNA中扩增出halC8的部分序列。将这段PCR 产物克隆到T-载体上，形成质粒pLYll，测序结果表明PCR产物所编码的氨基 酸是与Hal C8成熟蛋白的N端氨基酸序列是一致的。以pLYll作为模板，T7 RNA聚合酶转录出的RNA作为探针，采用Southern杂交等技术克隆了嗜盐菌 素C8的完整基因halC8，并且发现该基因位于AS7092的一个大质粒上。halC8 的开放阅读框为849个核苷酸，编码283个氨基酸；它必须要剪切掉N端的197 个氨基酸才能成为成熟的蛋白。它的一29～-24位置上是一“TATA”box序列， 为典型的嗜盐古菌启动子；它的转录起始位点距离“ATG”只有7个核苷酸， 也是典型的嗜盐古菌的“leadless transcript’。 关键词：极端嗜盐古菌嗜盐菌素分离纯化基因克隆 中国海洋大学博士学位论文Purification，gene 中国海洋大学博士学位论文 Purification，gene cloning and biological characterization ofhalocin C8，a novel peptide antibiotic from Halobacterium strain AS7092 Abstract Hatocins are bacteriocin—like proteins or peptides produced by many species of the family Halobacteriaceae and are externalized into the environment，where they kill or inhibit other haloarchaeons．Halocin is a useful model for studying the gene expression regulation and protein structure／function in the haloarchaea． In order to explore halocin diversity at both the protein and gene expression levels，22 haloarchaeal s仃ains