活性氧诱导生物活性分子自由基的自旋标记荧光法表征-分析化学专业论文.docx

摘要摘 摘要 摘 要 生物活性分子自由基的研究具有重要意义，通过对其产生位点、寿命、反 应活性、修复等机理的研究，能够进一步增加对生物分子的活性氧自由基损伤机 理的认识。生物活性分子自由基具有低浓度，短寿命以及高自聚反应活性等特点， 己建立的一些分析方法，如电子自旋共振法、免疫．自旋捕集法和质谱法，还不 能够满足对生物活性分子自由基进行原位、适时、动态检测的要求。荧光表征技 术具有表征参数多，动态范围宽，灵敏度高，操作简便等特点，尤其是已发展成 熟的荧光显微技术，为原位、实时研究在细胞中发生的化学反应工程提供了有效 的手段。然而，荧光分析技术在应用于生物活性自由基的研究时，尚缺乏灵敏、 特效的自由基荧光探针。本论文的研究目标在于开发生物活性自由基的荧光探 针，并研究其在表征生物活性自由基方面的应用。论文共分七章，包括前言、实 验材料与方法、肽碳中心自由基的荧光表征、肽硫中心自由基的荧光表征、肌红 蛋白自由基的荧光表征、血红蛋白自由基的荧光表征，核苷酸自由基的荧光表征。 第一章，前言，综述了近年来生物活性分子自由基分析表征研究的进展。 综述以活性氧诱导生物活性分子的氧化损伤，包括蛋白质的氧化损伤、DNA的 氧化损伤以及脂质过氧化为切入点，介绍了生物活性自由基分析表征研究的重要 意义。进而阐述了生物活性分子自由基的分析表征研究的现状，介绍了生物活性 自由基分析表征的实验技术，包括电子自旋捕集法、免疫自旋捕集法以及质谱法。 最后，在此基础上提出了论文的研究设想。 第二章，实验材料与方法，介绍了论文研究工作中所涉及的仪器与试剂， 介绍了自旋标记荧光探针(萘．氮氧自由基复合分子NA．Tempo‘和丫啶．氮氧自由 基复合分子Ac．Tempo‘)的合成与表征，以及生物样品的制备。 第三章，肽碳中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针 Ac．Tempo。表征肽碳中心自由基的研究。Ac-Tempo‘为弱荧光物质，当其捕集辣根 过氧化物酶催化H202氧化酪氨酸衍生物产生的碳中心自由基后，荧光性质显著 变化，为应用荧光参量表征酪氨酸自由基提供了基础。论文对反应的实验条件和 荧光表征的机理进行了系统的研究，并对荧光产物进行了分析认定。实验结果表 摘要明，根据实验条件的不同，自旋标记荧光探针Ac．Tempo‘或与肽碳中心自由基反 摘要 明，根据实验条件的不同，自旋标记荧光探针Ac．Tempo‘或与肽碳中心自由基反 应生成荧光物质4．(9．丫啶酯)．2，2，6，6．四甲基哌啶(Ac．piperidine)，或直接捕集 肽碳中心自由基生成荧光加合物。研究表明Ac．pipcddine的形成主要源自酪氨酸 自由基自身的共振结构，以及水中溶解氧的竞争反应。增加自旋标记荧光探针的 浓度或降低体系中溶解氧的浓度均可以促进加合物的生成，加合物的形成将为研 究自由基的形成位点和自由基的结构提供了有效的手段。相对于酪氨酸衍生物自 由基，Ac．Tempo‘对色氨酸衍生物产生的自由基的捕集效率较低，表明白旋标记 荧光探针对自由基的捕集受到空间位阻的影响。 第四章，肽硫中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针 Ac-Tempo‘表征肽硫中心自由基的研究。非荧光自旋标记荧光探针Ac-Tempo‘捕 集过氧亚硝酸以及Fcnton反应产生的‘OH氧化谷胱甘肽产生的硫中心自由基 后，荧光强度显著增加，为表征硫中心自由基提供了基础。论文对反应的实验条 件和荧光表征的机理进行了系统的研究。经HPLC．MS分析，表明At-Tempo’捕 集由过氧亚硝酸诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，生成荧光物质 Ac．pipefidine，Ac．Tempo。捕集由Fenton反应诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自 由基，产生的荧光物质为Ac．piperidine和4．(9．丫啶酯)．2，2，．二甲基吡咯 (Ac-pyrrolidine)。Ac-piperidme的形成源自Ac．Tempo。与硫中心自由基反应后形 成不稳定的N．O．S键的断裂。Ac．pyrrolidme的形成可能源自在GSH存在下 Fenton反应产生的Fe3+的作用。氮氧自由基为重要的自由基清除剂，研究其捕 集自由基及代谢机理，对其应用具有重要意义。本章实验结果表明，对于不同来 源的活性氧自由基，氮氧自由基与其反应后的产物不完全相同，这一结果为理解 氮氧自由基的代谢机理提供新的实验依据，丰富了氮氧自由基代谢的理论。 第五章，肌红蛋白自由基的荧光表征，介绍了应用白旋标记荧光探针 Ac．Tempo’表征肌红蛋白自由基的研究。本章的研究工作是以肌红蛋白以及心脏 组织匀浆液作为蛋白质模型，通过Ac-Tempo对H202氧化其产生的蛋白质自由 基进行表征。当Ac．Tempo捕集H202氧化肌红蛋白产生的蛋白质自由基后，荧 光强度显著增