蛋白质的通性、纯化实验和具体表征.ppt

一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 本 章 重 点 蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？ 主要纯化方法的原理？ 大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离 （5）加热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速？？ 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 破坏电荷情况 （一）目的 ◆ 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品； ◆ 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活； ◆ 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。 1、总目标 2、分离提纯的一般程序 第一步：前处理 ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 匀浆器 超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 （分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分 （differential centrifugation) 第二步：粗分级 第三步：细分级 四 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 不同分子量的蛋白质分子 1 透析和超滤 超滤装置 2 凝胶过滤 凝胶的网孔大小决定分离范围 能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围 Sephadex G-50 1 500~30 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量,如Sephadex G-50的极限为30 000 以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成 (2)凝胶过滤的原理 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 （二）根据溶解度差别纯化的方法 1. 等电点沉淀和pH控制 2. 盐溶和盐析 盐溶原理示意图 盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。 盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层 盐析原理示意图 应用 3. 有机溶剂分级法 有机溶剂分级分离原理示意图 4 温度对溶解度的影响 电泳的发展 a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。 （2）等电点聚焦 （3）双向凝胶电泳 2.离子交换层析法 不同载体： 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖 离子交换剂的构成 纤维素－O-CH2－COO-－Na+ DEAE anion exchanger CMC Cation Exchanger 亲和层析法(AC) 配体的选择 可选择配体的种类： 抑制剂 效应物 酶的辅助因子 类似底物 抗体 其它（外源凝集素，PolyA， PolyU 金属离子） （六） HPLC 原理：ＩＥＣ，GF，吸附层析 技术上的改进 颗粒力度小而均匀，机械性能强化学性能稳定 高压柱，计算机辅助设备 五蛋白质相对分子量的测定 1.凝胶过滤法测定相对分子质量 Note： 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。 因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形） 分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。 优点