常用的分子生物学技术原理及科学应用.ppt

* Suzhou University * * Suzhou University * * Suzhou University * * Suzhou University * * Suzhou University * (2)萤火虫荧光素酶(Luc) 　应用可穿过质膜的可溶性荧光素酶底物－不带电荷的荧光素酯类。这种底物很溶易穿过酯双层膜，一旦进入细胞即被内源性的酯酶转变成萤火虫荧光素，成为Luc的底物。 * Suzhou University * (3) ?-半乳糖苷酶 在活细胞中可用荧光素二- ?-D半乳吡喃糖苷(FDG)进行。FDG在低渗条件下加入而进入活细胞内，被?-半乳糖苷酶切割后因反应产物的疏水结构而被“ 困”在细胞内。通过底物代谢物的荧光成分发出的荧光而被检测。 * Suzhou University * 第十节　包载载体(entrapment vectors) 包载载体是含有报道基因的结构。它整合于基因组的随机位点，通过报道基因产生的表达模式，对附近的顺式调节元件作出反应。 包载载体有3类，用于果蝇的P因子载体，植物的Ac-Ds因子和小鼠的转基因 * Suzhou University * * Suzhou University * * Suzhou University * 第十一节　定点突变(site-directed mutagenesis or site-specific mutagenesis 运用cDNA技术在基因组的一个预定位点 产生点突变（point mutaion）。方法是逐步合 成一条基因组核酸链，使其中特定位点上一个 天然存在的碱基被另一碱基取代（如鸟嘌呤取 代腺嘌呤），纯化后，经过体外复制使在互补 链对应位点产生对应碱基置换。 * Suzhou University * 1.寡核苷酸引物诱导突变 (1)正链的合成：按体外重组技术，将突变的 目的基因插入M13单链模板上。 (2)合成突变引物 (3)制备异源双链：用Kleanow酶，和T4连接酶 在体外合成异源双链； (4)富集异源双链；用SI酶或蔗糖梯度离心去除开环产物(有很高的转化本底)。 (5)转化E.coli进行扩增； (6)筛选突变体：用标记探针和噬菌斑杂交 * Suzhou University * 寡核苷酸引物诱导突变 * Suzhou University * 2.Kunkel 定点诱变法 　由Kunkel,T.A.1985年建立 (1)将已插入目的DNA的M13 (RF)转化入 E.coli(dut-ung-)进行复制,子链中掺入了U； (2)与突变引物退火:取正链M13与突变引物退火; (3)制备异源双链：用Klenow酶，和T4连接酶 在体外合成异源双链； (4)将异源双链转化入野生型E.coli中，尿嘧啶脱 糖苷酶(Ung)降解含U的模板，仅含突变DNA的模板可得到扩增。 * Suzhou University * Kunkel 定点诱变法 尿嘧啶脱糖苷酶(Ung)降解含U的模板 * Suzhou University * 3.硫代磷酸诱变法 已知有一些核酸内切(BanII,HindII,PstI,NciI等)不能切割硫代磷酸DNA分子。 此方法的步骤是： (1)将突变的寡核苷酸引物与M13重组体退火； (2)在具有硫代磷酸的条件下，加入DNA pol合成新链。如此产生的异源双链分子中，突变体链是硫代磷酸化的DNA; (3)经连接酶封口后,用NciI消化异源双链。那么被切割的将是非硫代磷酸化的亲本链。 * Suzhou University * 硫代脱氧胞苷三磷酸(dCTP?S) 一种硫代核苷酸的分子结构 * Suzhou University * 硫代磷酸诱变法 * Suzhou University * 4.PCR诱变法 以上方法的缺点是突变位点仅限于靶DNA的5’ 端，而我们也希望在中心部位进行诱变。欲达 此目的可用PCR法。因PCR产生的单个错配碱 基经扩增会掺入到模板序列中，最终产生突变 体的双链。 后 Higuchi,R等又建立了重组PCR，此法可在　DNA序列的任何部位产生突变位点。 * Suzhou University * * Suzhou University * 5.大引物诱变法 重组PCR诱变法需4种引物，三轮扩增，步骤繁琐。于是后人又提出大引物诱变法。 PCR法的缺点是： (1)扩增的产物常需要连接到载体上，然后才能对突变的基因进行表达，研究。 (2)DNA的保真度低，产物需要经测序。 * Suzh