免疫组化原理-2012.4.2课件.pptVIP

免疫组化的原理;免疫组化原理;原理： 组织或细胞内的某种化学物质（待检测物） 抗原 免疫动物 抗体 检测（免疫组织化学） 荧光素 酶 金、银颗粒 ;三、免疫组化染色方法的类别;直接法;间接法;PAP法过氧化酶-抗过氧化酶法;PAP法（过氧化酶-抗过氧化酶法）;ABC法（亲和素-生物素法）;亲和素;LSAB（SP）法标记的链霉亲和素-生物素法; 酶标亲和素;一步法（EPOS）及两步法（Envision）;多聚物载体;辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRP?H2O2 有色分子终末产物 + HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP?H2O2：酶?底物复合物 受氢体为过氧化氢； 供氢体较多包括DAB； ; PBS的PH和离子强度的使用;免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体 ;三 免疫组化的基本流程;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍; 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关。一般37度1-2h，或4度过夜和从冰箱拿出后常温复温45min。;免疫组化原理及流程介绍; 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 ;;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1, 盐酸酒精:使用浓度1% 36-38%盐酸：1ml 75%乙醇：99ml 2, 氨水：使用浓度为0.2% 25-28%:0.2ml 自来水:100ml 3，素木精染色原理 素木精为碱性天然燃料，可使核??色。细胞核内染色质的成分主要为DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的素木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。素木精在碱性溶液中呈蓝色。;4，盐酸酒精的分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程为分化作用。所用的溶液称为分化液。酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而退色。经苏木精染色后，必须用1%的盐酸酒精分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去。 5，返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下，处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下，处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经1%的盐酸酒精分化后呈红色或粉色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色。