免疫学诊断课件.ppt

生物技术学院抗体工程研究所 2009年6月11日;分子诊断学;生化产品30％ 免疫产品25% 基因产品5％～8％ 血液分析产品8％～10％ 尿液分析产品3％~5% 微生物产品2％～3％;免疫学检验项目分布情况;主要内容;1、特异性 2、可见性 3、可逆性;;1、天然抗原 2、重组抗原 3、合成肽;标记免疫学分析技术发展历程;①免疫荧光;一、酶免疫分析技术; 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA ）基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。;①来源方便，易于纯化； ②比活性高，性质稳定； ③与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性； ④待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干扰因素； ⑤酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。 ;底物为邻苯二胺(OPD), 橙红色 ，检测波长492nm； 四甲基联苯胺(TMB)， 蓝绿色，检测波长450nm ;碱性磷酸酶;固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 ;双抗体夹心法测抗原 双抗原夹心法测抗体 间接法测抗体 竞争法测抗体 竞争法测抗原 捕获包被法测抗体 BAS-ELISA法;(1)双抗体夹心法测抗原;在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成?“夹心复合物”。所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook?effect)。 类风湿因子（?RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。表现出假阳性反应。; 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。 抗-HBs、抗-HCV、抗-HIV的检测常采用本法。;(3)间接法测抗体 ;(4)竞争法测抗体 ;(5)竞争法测抗原;(6)捕获包被法测抗体;(7) BAS-ELISA法 ;酶标记抗原或抗体的方法;酶标记抗原或抗体的方法;酶标记物的纯化;最适工作浓度的选择（间接法） ;间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择;双抗体夹心法工作浓度的选择(棋盘法);固相载体的选择 包被 封闭 加样 保温 洗涤 显色;不同批号的试剂盒不要混用。 整个实验过程应尽量建立在干净无尘的环境下进行。 试剂盒与待检样本使用前必须平衡至室温。; 酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。; 以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG?抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部?读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。;包被液：?碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6), PBS (pH=7.4), Tris-HCl (pH=7.8) 包被浓度：100ng/ml-20ug/ml 温度和时间：在4-8℃过夜或37℃ 2小时 ; 封闭?(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 0.05%-0.5%的牛血清白蛋白 10%的小牛血清 1%明胶 5%脱脂奶?粉; 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。 吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成污染 每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染； 酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加液过程迅速完成。;37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度； 室温较37℃可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡； 抗原抗体反应在4℃过夜反应更为彻底。;决定着实验的成败 ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 常用洗涤液为pH7.4 PBS-Tween--20 。 手工洗板时要注意防止气泡产生。 洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。; HRP-TMB显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液(2mol/LH2SO4)则会使蓝色转变成黄色，