抗体纯化以及蛋白浓度测定程序-ABclonal.PDF

抗体纯化以及蛋白浓度测定程序 操作程序 实验试剂及仪器 试剂：Sulfolink couping gel （THERMO ）、层析柱、氯化钠、1*PBS 、1M Tris、100mM 甘 氨酸（pH2.2 ）、EDTA(pH 8.5)、甘油 仪器：恒流泵、旋转培养器 流程：（一）亲和层析柱的制备 原理：活化的琼脂糖凝胶通过偶联抗原蛋白的巯基，从而使抗原结合在固相载体上 试剂：偶联 Buffer (50mM tris、5Mm EDTA-NA)PH 8.5 Wash buffer(1*PBS 320mM 氯化钠) 1) 称取 8-10mg 多肽，用 2ml 偶联 Buffer 溶解，蛋白则根据蛋白 浓度取合适体积，总含量在 10mg 左右。 2) 取 2ml Sulfolink couping gel 于层析柱中，将抗原加入层析柱于旋转培养器上旋转 2-3 小时 （二）抗血清纯化 1) 将层析柱静置在层析架上 30 分钟，连接恒流泵。 1 2) 平衡 40ml 1*PBS 流速 2.0、30ml 1*Gly、30ml 1*PBS 将柱子内环境平衡到中性 3) 上样 样品中加入 1/20 4M 氯化钠，流速 1.3-1.6 ，过柱两遍 4) WASH 加入 40ml Wash buffer 5) 收样 加入 1*Gly 流速 0.5-0.7,收集 8 管，每管 2ml 共 16ml。 6) 收集完之后，加入过量的酸将抗体洗脱干净，再用 1*PBS 平衡到中性 7) 将收集的抗体放入透析袋中，混匀之后取 30 微升左右用于抗体浓度测定，其余放入 1*PBS 50%甘油中透析浓缩过夜 8) 将透析浓缩好的抗体放入灭菌的 5 毫升冻存管中，贴上标签-20 摄氏度保存 注意事项：1.纯化过程中琼脂糖保持在液体环境中，切忌抽干 2.上样及洗脱流速不可过快 3.对于纯化磷酸化修饰或者其他修饰的抗体时，则需要 先过其对照柱两遍，其中收集一遍，在纯化磷酸化抗体 项目：LOWRY 法测蛋白 原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐— 磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物），在 一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含 量 试剂：Folin—酚试剂、4%碳酸钠溶液、0.2mol/L 氢氧化钠溶液、0.04mol/L 硫酸铜溶液、 2%酒石酸钾钠溶液、1mg/ml BSA、1*PBS 2 碱性铜溶液：按比例取试剂配置而成 仪器：恒温箱、分光光度计 流程 1. 根据蛋白质浓度，分别精确量取不同体积的标准蛋白质溶液，各加 PBS 补至 0.2ml ，使标 准蛋白的溶度分别为 0 ，12.5 ，25 ，50 ，100 ，200 ∪g/ml 2. 精确量取样品加 PBS 补至 0.2ml 3. 将标准曲线和样品各加 1ml 碱性铜和 0.1ml 酚试剂混匀，在 750nm 处测 OD 4. 以标准蛋白的浓度为Y 轴，光吸收值为 X 轴，得一标准曲线。由样品的光吸收值计算其浓 度 3