北大医学部复习资料曾慧慧部分增补.docxVIP

曾慧慧部分增补 曾慧慧每年都会考PBL的内容。今年的PBL题目有：1.细胞膜中蛋白质提取 2.细胞破碎应用3.核酸分子获得 4.干细胞获得 5.离心技术应用——对应的是Alice总结里的第二部分。由于每年学生的选题都不一样，所以考的肯定也不一样，需要重新整理一下。 这里面2.细胞破碎技术、5.离心技术都是基础技术，可以为其他三个题提供技术支持所以，几乎每年必讲的，所以要好好留心。3.核酸分子获得与4.干细胞获得二者都是比较具体的技术，但实际上也挺空的，所以只要知道大体在干什么即可，一些很细节的技术点可以忽略。而1.细胞膜中提取蛋白质是对2.细胞破碎技术、5.离心技术，以及往年很喜欢考的“分离纯化”技术（今年没人选这个题）的综合应用，估计形式上可能是考察重点（如果出大题的话，曾慧慧的始终大题在某种PBL技术与氧化应激间来回徘徊），但可能是个壳子，考的还是这几种基础技术。 对了顺便说一句，曾慧慧喜欢考注意事项。 上面这张图我是找来的一幅能很好的说明PBL所讲技术之间关系的流程图。图中可见大概的顺序是预处理→细胞分离→细胞破碎（如果需要细胞内含物的话）→碎片分离→纯化。我们接下来就大致以这个顺序总结。 上面这副图还给出了2009级两道填空题的答案，生物提取分离中，获取细胞的方法（细胞分离技术），获取细胞内含物的方法（细胞破碎技术）。 预处理 见Alice部分，今年没有讲。 细胞破碎技术 今年的与Alice所总结的有所出入，考察的内容可能更偏向今年，不过Alice总结的也是有意义的。所以我这里总结的更多是跟上时代的步伐，防止今年出新题。Alice总结的还是主流，需要好好看看。如果出问答题上你罗列破碎技术的种类或者应用时，把两份总结杂糅就好！ 细胞破碎的定义：参照名解 具体方法（千万不要死记硬背占脑容积，因为是学生做的PPT，没有标答，意思对即可） 高压匀浆法：利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击造成细胞破裂。 优点：操作参数少，样品损失量少。 存在的问题：较易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器质地坚硬易损伤匀浆阀，不适合用该法处理。（缺点也可以当做注意事项答：例如这里答，注意保护匀浆阀，不要混入团装丝状真菌） 设备是高压匀浆器 高速珠磨法：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物。 优点：减少了产物失活的可能性，破碎效率高，适用于连续操作且适用范围较广泛。 存在的问题：操作参数多，一般凭经验估计，并且珠子之间的液体损失30%左右。 设备是高速珠磨机 超声破碎法：由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液，超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。 优点：超声破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液体损失少。 存在的问题：超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活，且其噪声令人难以忍受，而且大容量装置的声能传递、散热均有困难，因而超声破碎的工业应用潜力有限。 设备是超声波细胞破碎仪 酶溶法：（Alice中有酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶（lysozyme)、β-1,3-葡聚糖酶（glucanase)、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶（mannanase)、糖苷酶（glycosidase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶（chitinase)等。溶菌酶主要对细菌类有作用，其它酶对酵母作用显著。 优点：选择性释放产物，核酸泄出量少，细胞外形完整。 存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加了分离纯化溶酶的操作。另外溶酶法通用性差，不同物料和菌种需选择不同的酶。 化学渗透法：（Alice总结里的化学破碎法） 某些有机溶剂（如苯、甲苯、氯仿）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或细胞膜的通透性从而使内容物有选择地渗透出来。化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和细胞膜的结构与组成。 例如，EDTA作为螯合剂，可以用于处理革兰氏阴性菌，对细胞的外层膜有破坏作用。甲苯能溶解细胞膜的磷脂层。 存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差，某种试剂只能作用于某