mirna荧光素酶报告基因.docxVIP

mirna荧光素酶报告基因 　　近年来人工合成的miRNA已经成功应用于沉默预期靶基因的表达及其功能研究，人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNAmimics进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性研究；相反，使用化学合成的方法合成miRNAinhibitors，特异的靶向和敲除单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成miRNAmimics和inhibitors是近年来研究的一个新热点，已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。　　最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“oncomirs　　什么是miRNA　　MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。miRNA的特征　　已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。　　最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性，Lau和Bartel实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物。　　Bantam最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段　　的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个　　片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anophelesgambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNAfoldingprogram(mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northernblot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantammiRNA，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实bantammiRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hidmRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点，并证实bantammiRNA抑制hid的翻译而非转录。　　miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。　　miRNA的功能　　对microRNAs(miRNAs)的研究正在不断增加，原因是科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。　　第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewedinPasquinelliXX)。　　bantammiRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一