细菌内毒素检查法.ppt

细菌内毒素检查法 南京市药品检验所 仝立卿 2008.12 细菌和细菌毒素的概念 细菌Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。按革兰氏染色法分为G-和G+。两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。其共同成分为肽聚糖。 细菌毒素：病原性细菌产生的毒素。可分为两类： 1.外毒素：Exotoxin是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。几乎无发热性。毒性强。 2.内毒素：Endotoxin是G-菌细胞壁外层上的特有结构，细菌在生活状态时不释放，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A成分。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液，可使血管透性改变，局部出血，颗粒性白细胞增多或减少和体重下降，严重时能导致内毒素性休克。 细菌内毒素的生物活性 内毒素的三个“两性”特征： 两性分子：亲水性、疏水性； 两级电荷：携带正负电荷； 两相作用：具毒害、有益作用。 不同水平上的生物活性： 机体水平：发热性、致死毒性、白血球减少等； 细胞水平：巨噬细胞的活性化、阻止巨噬细胞游走、前列腺 素的产生、抗肿瘤坏死作用； 分子水平：补体活化性、鲎细胞溶解物聚集等。 细菌内毒素的耐热性 250℃30分钟以上的干热灭菌处理才能使其灭活 细菌内毒素标准品 菌株选择：一般均使用发热活性强的大肠杆菌。必须满足的条件： 1.菌株来源明确、有很好的稳定性。 2.能够确定其各种化学分析值。 3.具有很强的制热性与鲎试剂活性间有很好的相关性。 4.反应曲线应为直线型。 5.易溶于水、在冷冻状态下能长时间稳定贮存。 6.高纯度并能保证供应。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。目前使用的细菌内毒素工作标准品：150601-200859 （120EU/支） ? 细菌内毒素量值表示 细菌内毒素的标准量值即单位（Endotoxin Unit：EU） 七十年代以前用重量单位ng（毫微克）给内毒素标量，八十年代以后改为活性单位（促凝活性﹑致热活性）EU。同一重量的内毒素可因菌种的不同或制备技术的不同而得出不同的Eu值。 1980年，FDA制备第二批内毒素准品，命名为EC2，用它与一批标准鲎试剂做凝胶反应试验，同时也用它做家兔最低致热量试验，共做了56次，对照的结果是： 1．EC2的家兔最低致热量为1.04ng/kg（最低1.04ng/kg，最高1.79ng/kg，平均值为1.37ng/kg），就取为1ng/kg。 2．EC2对该标准鲎试剂的促凝胶活性为平均值0.194ng，就取0.2ng整数，并把这个最低促凝胶活性0.2ng值定为内毒素单位1Eu。0.2ng=1EU，亦即1ng=5EU。 细菌内毒素检查法反应机理 细菌内毒素 ? 因子C 活化因子C （1-3）B-D-Glucan ? 或LAL-RM（反应物） 因子B 活化因子B 活化因子G 因子G ? ? 凝固酶原 凝固酶 ? 凝固蛋白原 凝固蛋白（形成凝胶） 细菌内毒素检查法历史 1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。1968年Levin和Bang合作建立了鲎试验方法。 在美国，鲎试验被称作为“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980年20版美国药典。 我国70年代中期开始开发研制。《中国药典》1990年版第二增补本正式收载细菌内毒素检查法但未涉及任何品种正文。 《中国药典》1995年版二部附录收载经修订后的细菌内毒素检查法，