核酸碱基薄层层析双波色谱扫描分析-遗传.PDF

遗传 HEREDITAS(Beijing) 6(4)3-51984 核酸碱基薄层层析双波色谱扫描分析 贾成 禹 窦永泽 （中国科学院成都生物研究所） 核酸组成成分及衍生物的分析除常用的电 10-9M)A,G,C,T,U,盛于不同容器中，再分 泳、纸层析和薄层层析洗脱比色法外，近年来 别称取同样量的上述各碱基混合于一个容器， 又出现了双波长色谱扫描法和高压液相层析 各加Iml水，1滴12NNaOH液助溶，后加 1 法[2,51。但已报道的双波长色谱扫描法测定的 滴浓 HCl，用 0.1NHCI稀释到5m1。将上 碱基种类不多，在测定DNA (G+C）克分 述硅胶薄层板于1050C活化半小时，按常法把 子外方面，尚未见报道。我们在实验中摸索出 单个及混合的碱基溶液分别点在不同的点上， 分离核酸碱基效果好的硅胶薄层析，并考查了 用饱和正丁醇上行展开至前沿 12cm处取 出， 双波长色谱扫描分析法的准确度。 时间1.5小时。层析后风千或吹干，于254nm 紫外灯上定位，画出各碱基斑点的位置，计算 材料和方法 Rf值。 一（）主要试剂及仪器 2.DNA碱基定量分析 1．试剂 碱基 A,G,C,T和U，均为 (1）标准曲线绘制：准确称取并按上法配 层析纯，含量＞98多；A,U德国产，C为BDH 成各种碱基浓度为5nM/冈的A,G,C,T标 产，G,T分别为上海东海制药厂和恒信化工厂 准碱基混合液，取活化的3块 20X10cm硅胶 产。小牛胸腺 DNA为上海牛奶公司产。薄层 板，每板点5点，分别为1,2,3,4,5冈，按前层 层析用硅胶H,为青岛海洋化工厂产。薄层层 析，用 CS-910双波长色谱扫描仪测定。测定 析用纤维素 (cellulosepulverMN300UV254)，德 条件：xS二265nm,AR二370nm，反射法，线 国产。 狡甲基纤维素钠为上海化学试剂厂产。 性扫描。用量高法计积分值，将各板中种类和 其他试剂为AR，水为重蒸水。 含量均相同的碱基之积分值加和平均，求各碱 2．仪器 日本岛律 CS-910双波长色 基积分值和 nM 之间关系的回归方程，作出以 谱扫描仪。 积分值 任（意单位）为Y,nM为X的回归直线， 二（）分析方法 即为标准曲线。 1.薄层层析分离 (2）样品测定：加 2mgDNA样品和 2m1 (1)制板：取 16.28硅胶 H,1.8gMN 88多甲酸于 GG17玻璃制的2m1安瓶中，按 30OUV254纤维素，0.5外挟甲基纤维素钠 离（ AaronBendicht4，法水解，依标准碱基溶液配法 心去除悬浮物）90ml，于匀浆器中匀浆5分钟， 溶成 0.2m1样品液。取不同量的样品液与 3o1 速度以浆液不溅出为度，抽气，均匀涂布在6块 标准碱基混合液点于同板的不同点上，层析和 20XlOcm或4块20X15cm的平整清洁的玻板 JiaChengyuetal.:AnalysisofNucleicAcidBases 上。 饰 ThinLayerChromatographyandDualWave- (2)薄层分离：称取 25X103nM(1nM二 lengthChromatogramScan 3 扫描测定后，选取积分值与标品积分值相差不 1示。对于核酸碱基薄层层析分离，大多数文 大的样品量作为测定点样量。 取3块薄层板， 献是使用纤维素板，据我们多