分子生物学幻灯片—蛋白质翻译.ppt

4 生物信息的传递（下）; 基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA；再由mRNA将遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程称翻译，即蛋白质的生物合成过程。;蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。 翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。 细胞所用来进行合成代谢总能量的90%消耗在蛋白质合成过程中，而参与蛋白质合成的各种组分约占细胞干质量的35%。;翻译过程： 翻译的起始：核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。 肽链的延伸：核糖体沿mRNA 5‘端向3’端移动，开始了从N端向C端的多肽合成。 肽链的终止与释放：核糖体从mRNA上解离。;在翻译过程中： 核糖体是蛋白质合成的场所。 mRNA是蛋白质合成的模板。 tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。 在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。;4.1 遗传密码——三联子;mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。 mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个AA，这3个核苷酸就称为密码，也叫三联子密码（codon) 翻译时从起始密码子开始，沿着mRNA5‘-3’连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链—蛋白质。;4.1.1 三联子密码及其破译;7.2.2.1 遗传密码的推测;确认三联子： 1 移码突变 2 烟草坏死病外壳蛋白亚基400aa/1200bp; 破译密码子最简单的方法是将DNA或mRNA的顺序与多肽进行比较。 （1）体外翻译系统的建立 在生物体内，蛋白质合成过程中需要200多种生物大分子参加，包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。 在体外能否进行蛋白质的合成？; 1962年，用E. coil提取液进行体外合成实验，加入细菌病毒f2的mRNA，合成了与天然f2蛋白完全相同的蛋白质。证明在体外条件下可准确地按mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质。 现在已用无细胞系统合成多种病毒和细菌蛋白以及哺乳动物蛋白（如血红蛋白、轻链和重链免疫球蛋白、肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白等），证明高等生物蛋白也能在体外合成。; 用于蛋白质生物合成研究的体外翻译系统主要有：细菌（大肠杆菌）无细胞系统、动物无核细胞系统、网织红细胞裂解系统和麦胚系统等。 只要加入外源mRNA模板，则可进行体外翻译。;（2）核酸的人工合成技术的发展; Speyer等（1963）用人工合成2个碱基的共聚物(mixed copolymers)破译密码的方法。 以A和C原料合成polyAC。polyAC包含有8种不同的密码子，实验中AC共聚物作模板翻译出的肽链由6种氨基酸组成，其中两种已证明是CCC和AAA。 这些氨基酸的掺入比例随A/C比率而异。如多聚AC中A的量大大超过C的量，则Gln的参入大大多于 His，可推断Gln的密码子含2A和1C，而His的密码子含2C和1A；但此方法不能确定A和C的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成。 用其它2个碱基的共聚物进行类似的实验，也可以推断出其他密码子的碱基组成，但不能确定密码子中碱基排列。 ; A/C共聚核苷： CCC CCA CAC ACC CAA ACA AAC AAA Pro Pro His Thr Gln Thr Asn Lys 多聚二核苷酸poly UG: UGUGUGUGUGUGUGUGUG - CysValCysValCysVal 多聚三核苷酸poly UUC: UUCUUCUUCUUCUUCUUC - PhePhePhePhePhePhe UCUUCUUCUUCUUCUUCU - SerSerSerSerSerSer CUUCUUCUUCUUCUUCUU - LueLueLueLueLueLue;（3）核糖体结合技术（ribosome binding technique）;;方法： ①合成1个三联体核苷酸（RNA）模拟一个密码子，如UUU。 ②准备各种负载tRNA，如Thr、Phe或Lys的tRNA混合物，并将其中的一种氨基酸（如Phe）用放射性元素标记。 ③将密码子、负载tRNA及核糖体一起放入硝酸纤维滤膜。游离的密码子和负载tRNA会被洗脱而通过滤膜，核糖体无法通过滤膜。但与密码子对应的tRNA能与密码子一起与核糖体结合而留在滤膜上。 ④检验滤膜看是否含放射性元素。若有放射性，表明此标记氨基酸(Phe) 与此密码子(UUU)对应。否则，二者无对应关系。 ⑤合成其它密码子并标记其他氨基酸重复此实验