分子生物学研究策略-基因表达技术(10月25日)课件.ppt

分子生物学研究策略 Research Strategy on Molecular Biology;**基因表达系统;1、大肠杆菌表达系统（Gene Expression system in E.coli）;2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势;真核基因在不同表达系统的表达; 2、芽胞杆菌表达系统（Gene Expression system in Bacillus）;2）枯草杆菌宿主菌株 由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效 （1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入 （2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移 ;3）、可作为宿主的其它菌种： 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus ?-淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽 ??大芽孢杆菌Bacillus megaterium 淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 蛋白酶;球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白 嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温?-淀粉酶 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白 耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis ;4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势;3、乳酸菌基因表达系统（Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria）;Lactic Acid Bacteria;2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点;3）研究进展;（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ） SDS;（3）抗微生物和食品腐败;（4）细胞表面层和外多糖 利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管电泳鉴定技术。 ;（6）分子遗传学 基因克隆 表达调控 染色体分析;（7）益生菌（PROBIOTICS） Lactobacillus and Bifidobacterium;食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公认的安全的食品级微生物的基因，因此具有某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。 1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全的食品级微生物； 2、载体必须是食品级的，不得含有非食品级的功能性DNA 片段； 3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、营养缺陷型标记等； 4、宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当的分子生物学方法如DNA序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组成。;食品级载体不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更为安全，在食品、医药方面具有广泛的应用潜力。 乳酸菌的食品级 高效诱导分泌表 达NICE系统是可 控制的蛋白质生 产的最理想的系 统。 ;4、链霉菌基因表达系统（Gene Expression system in  Streptomyces ）;2）链霉菌的载体 （1）高拷贝载体 pIJ101 40-800 拷贝 硫链丝菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel） （2）低拷贝载体 pIJ920 1-2拷贝 广泛宿主 能插入大于30kb的片段 （3）穿梭载体 pHJL210（SCP2*/pBR322） （4）柯斯载体（cosmid） 构建基因文库;（5）接合转移载体 pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（转移功能） （6）噬菌体载体 ?C31衍生的，如KC304， KC505 （7）表达载体 利用PtipA启动子构建的表达载体 pIJ6021 （8）分泌载体 利用S.longisporus